摘要：【目的】了解碳酸盐碱度对罗非鱼的毒性及其相應耐受机制，为耐盐碱罗非鱼育种及生产应用提供理论指导。【方法】将尼罗罗非鱼从淡水直接转入4个碳酸盐碱度处理（4.0、6.0、8.0和10.0 g/L NaHCO3）中进行急性胁迫试验，利用pH计、紫外分光光度计及荧光定量PCR，分别检测胁迫0.5、1.0、4.0、6.0、9.0、12.0、18.0、24.0、36.0和48.0 h的罗非鱼血清pH、游离氨浓度及肾组织中碳酸酐酶（CA）和谷氨酰胺合成酶（GS）基因的相对表达量。【结果】在各碳酸盐碱度处理组中，胁迫1.0 h后罗非鱼的血清pH、游离氨浓度均发生显著变化（P<0.05）。经4.0和6.0 g/L碳酸盐碱度胁迫48.0 h后未出现死鱼现象，其血清pH、游离氨浓度及CA基因、GS基因的表达量均呈先升高再降低的变化趋势；经8.0 g/L碳酸盐碱度胁迫9.0 h后陆续出现死鱼现象，血清pH高达8.11、游离氨浓度为486.28 μmol/L，至胁迫12.0 h后罗非鱼全部死亡；经10.0 g/L碳酸盐碱度胁迫出现死鱼的时间明显早于8.0 g/L碳酸盐碱度胁迫，胁迫1.0 h后其血清pH达8.14、游离氨浓度为365.89 μmol/L，胁迫4.0 h后罗非鱼全部死亡。【结论】尼罗罗非鱼能耐受的血清pH上限在8.10附近，耐受的游离氨浓度为525.66 μmol/L。在低碳酸盐碱度（小于6.0 g/L）胁迫下，尼罗罗非鱼可通过生理调控血清pH和游离氨浓度而适应胁迫逆境，且CA和GS参与了相应离子的转运及氨氮代谢。
关键词： 尼罗罗非鱼；碳酸盐碱度；血清pH；游离氨；CA基因；GS基因
中图分类号： S965.125 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）06-1032-07
0 引言
【研究意义】我国约有3067万ha盐碱水域，但由于碳酸盐碱度和pH较高，大多数盐碱水域水体中的生物资源较贫瘠，基本处于闲置状态（么宗利等，2010）。近年来，上海海洋大学以尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）为对象，用氯化钠、碳酸盐等自制盐碱性水体开展耐盐碱罗非鱼新品种选育工作（赵丽慧等，2013），同时开展鱼类盐碱胁迫应答及高盐碱耐受机制研究（赵丽慧等，2014b），以期选育出适合盐碱水域的养殖品种，有效利用盐碱水资源发展生态农业，这对破解某些地区长期制约渔业发展的难题，实现当地生产与生态相互协调、渔业转型升级具有重要意义。【前人研究进展】目前，有关碳酸盐碱度对鱼类毒性及相应耐受性的研究较多，包括碳酸盐碱度胁迫后鲤、鲢、鳙、草鱼、尼罗罗非鱼（雷衍之等，1985）、彭泽鲫（郑伟刚等，2004）、青鳉（Yao et al.，2010）、大鳞鲃（徐伟等，2011）和达里湖鲫（周伟江等，2013）的存活能力均有报道，发现多数鱼类在碳酸盐碱胁迫后会出现异常的行为及形态特征，如急游冲撞、迅速翻白上浮、体表分泌大量黏液、鳃部出血、快速死亡，死亡鱼的头部发黑、体表泛青色、鳃片暗红或紫褐色，且部分鱼的腹部膨大或胸部呈微黄色等（雷衍之等，1985；章征忠等，1999）。为了应对盐碱胁迫，鱼类会通过启动信号传导、酸碱平衡、渗透压、代谢、呼吸和免疫等调控机制，在一定范围内维持机体的生理平衡，但这个生理过程会消耗能量，且涉及众多基因的相互作用（郭雯翡等，2012；Yao et al.，2012）。刘济源等（2012）在对青海湖裸鲤进行碳酸盐碱度胁迫的研究中，发现青海湖裸鲤血浆渗透压和Na+、Cl-、Ca2+离子浓度在碳酸盐碱度胁迫96 h内未出现显著变化；郭雯翡等（2012）研究盐碱胁迫下青海湖裸鲤鳃基因表达的差异情况，结果表明，高盐碱胁迫会改变鱼类的渗透压和酸碱平衡，对免疫系统产生一定的抑制作用，即鱼类通过增强离子调控、提高血清尿素氮浓度、合成应激蛋白等生理活动来维持渗透压和酸碱平衡，缓解应激反应；王卓等（2013）研究发现，在碳酸盐碱度胁迫下青海湖裸鲤的SOD、ACP和AKP活性均在发生显著变化后又快速恢复到初始水平。【本研究切入点】尼罗罗非鱼是世界性的淡水养殖鱼类，对碳酸盐碱度的耐受性较一般养殖鱼类高（史为良，1981），在碳酸盐碱度41.6 mmol/L、pH 9.42的水体中仍可存活（雷衍之等，1985），但至今尚未明确碳酸盐碱度胁迫对尼罗罗非鱼体内血清pH和游离氨浓度的影响，在其他鱼类上也未见相关的研究报道。【拟解决的关键问题】对尼罗罗非鱼进行碳酸盐碱度胁迫后测定其体内血清pH、游离氨浓度及肾组织碳酸酐酶（Carbonic anhydrase，CA）和谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）基因的相对表达量，以期从生理生化角度揭示碳酸盐碱度对罗非鱼的毒性及其相应的耐受机制，为耐盐碱罗非鱼育种及生产应用提供理论指导。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
尼罗罗非鱼于2014年10月取自上海海洋大学罗非鱼种质资源试验站，淡水饲养于上海海洋大学养殖中心控温循环水族箱中，水温（25.3±0.8）℃，光照条件为室内自然光，每天定时投食2次，及时清理粪便和残余饵料。选取体质健康、规格均匀（平均体重82.2±5.4 g）的个体进行急性胁迫试验。试验用盐碱水体均提前配置，并根据水族箱体积计算所需NaHCO3（分析纯），将相应NaHCO3加入到完全曝气的自来水中，均匀搅拌，连续充氧48 h，待其稳定后使用。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 试验设计 设4个碳酸盐碱度处理组（处理1～4），对应的NaHCO3浓度分别为4.0、6.0、8.0和10.0 g/L，以充分曝气的自来水为对照组（CK）。其中，处理1（4.0 g/L NaHCO3）中溶解氧7.2 mg/L、氨氮0.43 mg/L、pH 8.90；处理2（6.0 g/L NaHCO3）中溶解氧7.4 mg/L、氨氮0.42 mg/L、pH 9.09；处理3（8.0 g/L NaHCO3）中溶解氧7.3 mg/L、氨氮0.46 mg/L、pH 9.10；处理4（10.0 g/L NaHCO3）中溶解氧7.2 mg/L、氨氮0.43 mg/L、pH 9.20。试验前1 d开始禁食，试验过程中不投放饵料。将试验鱼从淡水中捞出，直接放入各碳酸盐碱度处理组中，每组35尾鱼，设3个重复。