[摘要] 目的 探討miRNA-1表达水平和心肺复苏后心功能障碍严重程度的相关性。 方法 选择2014年2月～2016年2月期间在本院急诊科心肺复苏成功的心脏骤停患者62例作为病例组，按年龄、性别匹配取62例健康自愿者作为对照组，采用Real-time PCR检测miRNA-1表达水平。观察病例组患者超声心动图心功能各项指标，分析miRNA-1表达水平与心功能障碍严重程度的相关性。 结果 病例组miRNA-1表达水平明显高于对照组（P<0.05），心功能Ⅳ级组miRNA-1表达水平明显高于心功能Ⅲ级组（P<0.05），miRNA-1表达水平与心功能指标E峰、E/A值、LVEF、LVEDD呈负相关（P<0.05），miRNA-1表达水平与心功能障碍严重程度呈正相关（r=0.864， P<0.01）。 结论 miRNA-1参与了心肺复苏后心肌细胞凋亡的发生和发展，与心功能障碍严重程度密切相关，其具体途径可能是通过调节靶基因从而促进或抑制靶基因蛋白表达而实现。
[关键词] 心肺复苏术；miRNA-1；心功能障碍；严重程度
[中图分类号] R605.974 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）11-0005-03
Correlation study of miRNA-1 and severity of cardiac dysfunction after cardiopulmonary resuscitation
DAI Beijun1 ZHANG Meiqi2 WENG Jianfeng3 HU Zhibin1
1.Department of Cardiothoracic Surgery，Zhejiang Provincal People’s Hospital， Hangzhou 310014， China；2.Department of Emergency，Zhejiang People’s Hospital， Hangzhou 310014， China；3.Zhejiang University of Science and Technology， Hangzhou 310012，China
[Abstract] Objective To investigate the correlation between the expression level of miRNA-1 and the severity of cardiac dysfunction after cardiopulmonary resuscitation. Methods 62 patients with cardiac arrest who were given cardiopulmonary resuscitation in the Emergency Department in our hospital from February 2014 to February 2016 were assigned to the subject group. 62 healthy volunteers were assigned to the control group by age and gender. The expression level of miRNA-1 was tested by real-time PCR. The indices of cardiac function were observed in the subject group by echocardiography， and the correlation between the expression level of miRNA-1 and the severity of cardiac dysfunction was analyzed. Results The expression level of miRNA-1 in the subject group was significantly higher than that in the control group （P<0.05）. The expression level of miRNA-1 in the cardiac function level Ⅳ group was significantly higher than that in the cardiac function level Ⅲ group（P<0.05）. The expression level of miRNA-1 was negatively correlated with E-peak， E/A value， LVEF and LVEDD（P<0.05）. The expression level of miRNA-1 was positively correlated with the severity of cardiac dysfunction（r=0.864， P<0.01）. Conclusion miRNA-1 participates in the occurrence and progression of myocardial apoptosis after cardiopulmonary resuscitation， and it is closely related to the severity of cardiac dysfunction. The specific pathway may be obtained by modulating the target gene in order to promote or inhibit the expression of the target gene protein.
[Key words] Cardiopulmonary resuscitation；miRNA-1；Cardiac dysfunction；Severity
心肺复苏术（cardiopulmonary resuscitation，CPR）是一种救助心搏骤停患者的急救措施，通过人工保持心功能直到自然呼吸和血液循环恢复。由于缺血-再灌注、各种心律失常等诱发因素导致患者心功能出现不同程度的功能障碍，是院内外心搏骤停患者自主循环恢复后早期死亡的重要原因之一[1]。有研究发现，miRNA-1在心脏发育过程中起着极其重要的功能作用，并参与心脏病发生、发展的过程[2]。近年来研究发现，循环miRNA-1表达水平与心肌梗死后心肌缺血程度存在显著正相关[3]。目前，miRNA-1是心肌细胞凋亡研究的热点，其在心肺复苏后的变化和作用的相关研究报道较为少见。因此，本研究观察心肺复苏后患者miRNA-1表达水平和心功能障碍严重程度的相关性，探讨其在心肺复苏后心功能障碍中的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2014年2月～2016年2月期间在本院急诊科心肺复苏成功的心脏骤停患者作为研究对象。纳入标准：（1）年龄≥18岁，性别不限；（2）入院前或入院后出现呼吸、心跳骤停，给予当场心肺复苏或拨打120后给予针对性的院前急救心肺复苏措施；（3）患者或家属签署知情同意书，自愿参加。排除标准：（1）急性心功能衰竭、急性心肌梗死导致的心跳骤停者；（2）存在慢性肝肾功能不全基础病变的患者。符合纳入标准的患者共62例作为病例组，其中男35例，女27例，年龄18～55岁，平均（34.8±16.4）岁。按性别、年龄匹配，在本院体检中心健康人群中抽取62例作为对照组，其中男35例，女27例，年龄18～55岁，平均（34.2±16.2）岁。心功能分级参照美国纽约心脏病协会（NYHA）的分级标准进行分级，其中Ⅲ级33例，Ⅳ级29例。
1.2 方法
1.2.1 标本采集 分别采集病例组患者（心肺复苏后 6～8 h 内）和对照组肘静脉血5mL，采用3.8%枸橼酸钠抗凝，置于离心机进行离心（温度：4℃，1500 r/min，离心15 min），收集上层血浆，分装后置于-70℃低温冰箱保存备检。
1.2.2 检测方法 采用Trizol（Invitrogen）法提取血浆总RNA，血浆量为 1 mL。具体实验操作按照Trizol试剂盒附带的操作说明书进行。采用紫外分光光度计测吸光度值，计算RNA浓度，使用琼脂糖电泳鉴定RNA的完整性。逆转录合成cDNA：采用逆转录试剂盒（Fermentas）进行逆转录，反转录相关引物：上游引物：5’-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3’，下游引物：5’-ATGTCACGCACGATTTCCC-3’，擴增片段长度：263bp。miRNA-1上游引物：5’-GAGCAGGCTGGAGAA-3’，下游引物：5’-GGTGGAATGTAAAGAAGTC-3’，扩增片段长度：113bp。逆转录后采用Real-time PCR检测，采用U6作为内参，PCR扩增条件：95℃预变性5 min；95℃10 s，60℃30 s，45个循环。miRNA-1表达计算公式：ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因。
1.2.3心功能指标 病例组患者心肺复苏后6～8 h观察记录心功能指标：舒张早期充盈峰速度（E峰）、舒张晚期充盈峰速度（A峰）、E/A比值、左心室舒张末期直径（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）和射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）。检测时采取平卧位，进行心尖四腔切面彩色多普勒超声，每个指标数据重复测定 3 次，取平均值。
1.3 统计学方法
使用SPSS 21.0统计学软件对数据进行分析处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，符合正态分布使用独立t检验，不符合正态分布资料采用方差分析，等级相关采用Spearman相关分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 病例组和对照组miRNA-1表达水平的比较
病例组miRNA-1表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2 病例组心功能Ⅲ、Ⅳ级者miRNA-1表达水平的比较
两组资料不符合正态分布，采用方差分析，心功能Ⅳ级组miRNA-1表达水平明显高于心功能Ⅲ级组，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.3 miRNA-1表达水平与心功能指标的关系
miRNA-1表达水平与心功能指标E峰、E/A值、LVEF、LVEDD等呈负相关（P<0.05）。
2.4 miRNA-1表达水平与心功能障碍严重程度的相关性
Spearman相关分析显示，miRNA-1表达水平与心功能障碍严重程度呈正相关（r=0.864，P=0.000），见图1。
3 讨论
临床上经心肺复苏自主呼吸和循环恢复的患者仍面临死亡威胁，生存率较低。有研究报道，在心肺复苏后 7 d 内约有50%的患者因心功能障碍而导致死亡，心肺复苏后心功能障碍是心肺复苏成功后早期患者病死率高的重要原因之一。心肌细胞大量凋亡是心肺复苏后心功能障碍的机制之一，抑制心肌细胞凋亡发生发展可有效减轻心肺复苏后不可逆性心肌细胞损伤[4]。miRNA是一类由22～23个核糖核苷酸组成的内源性非编码微小RNA。miRNA能通过调节蛋白质的合成，进而对细胞的生长、发育、分化和凋亡进行调控[5]。目前有数十种在心肌细胞中被鉴定，其中miRNA-1能特异性分布于心肌细胞和骨骼肌，且被证实能对这些细胞的增殖、分化和凋亡进行调控，是近年来研究较多的与心脏疾病相关的miRNA，主要包括 miRNA-1-1 和 miRNA-1-2 两种，其基因长度均为21bp。miRNA-1 表达受到血清反应因子、肌细胞增强因子-2、肌肉调节因子等转录因子调控[6]。miRNA-1与心肌细胞的病理状态十分密切，李云等[7]研究发现，miRNA-1在冠状动脉疾病患者的心肌组织中呈高表达水平，且通过抑制钾离子通道Kir2.1亚基的编码基因KCNJ2和缝隙连接蛋白Cx43的编码基因GJA1转录后水平使细胞膜去极化、传导力下降，从而引起或加重心律失常的发生。有研究报道[8]，miRNA-1基因是肌细胞分化调节因子的直接靶向，具有诱导心脏肌成纤维细胞向心肌样细胞方向直接转分化的潜能。
国内肖祥等[9]研究发现，急性心肌梗死时心肌细胞的miRNA-1表達水平明显升高，且冠脉病变程度越大，心肌缺血越严重，miRNA-1表达水平越高，miRNA-1表达水平与心肌梗死后心肌缺血程度存在显著相关。Long G等[10]研究亦发现急性心肌梗死4 h后血液中miRNA-1表达水平明显升高，8 h 达到高峰，1周后恢复至正常范围。本研究结果显示，病例组miRNA-1表达水平明显高于对照组（P<0.05），与上述研究报道相一致，说明心肺复苏后患者miRNA-1表达水平升高。主要原因分析：Bcl-2基因是miRNA-1的靶基因之一，是目前较为公认与细胞凋亡密切相关的基因，在缺血再灌注损伤所致的细胞凋亡中发挥重要的调节作用，具有抑制凋亡作用，具有促进细胞生存、延长细胞寿命作用[11，12]。通过miRNA-1表达水平升高可引起Bcl-2基因家族表达异常可能是心肺复苏后心肌细胞凋亡的重要通路和机制之一，通过调控miRNA-1的表达可能可以减少心肺复苏后心肌损伤。
本研究结果也显示，心功能Ⅳ级组miRNA-1表达水平明显高于心功能Ⅲ级组，且miRNA-1表达水平与心肺复苏后心功能障碍严重程度呈正相关，与心功能指标E峰、E/A值、LVEF、LVEDD等呈负相关，说明miRNA-1表达水平与心功能密切相关，其表达水平与心功能障碍严重程度相一致。有研究[13-15]表明，急性心肌梗死后miRNA-1表达水平过高，可直接或间接介导钙离子通道调控发生紊乱失调而导致心脏电生理发生紊乱，引起心律失常，是心肺复苏患者早期死亡的主要原因。miRNA-1表达水平过高可抑制KCNJ2和GJA1的表达[16，17]，使心肌细胞膜去极化降低了心肌细胞的传导性，最终导致心律失常发生。王霁翔等[18]研究报道，通过转染miRNA-1mimics能够上调H9c2大鼠心肌细胞miRNA-1表达水平，心肌细胞凋亡率显著增加，心肌细胞生存率及蛋白表达水平显著下降。提示miRNA-1表达能抑制心肌细胞增殖，促进细胞凋亡。心肌梗死后，心肌细胞大量减少，成纤维细胞发生表型转化。张成等[19]研究表明，特定miRNAs可诱导心脏肌成纤维细胞表达心肌细胞特异性标志物，具备诱导心脏肌成纤维细胞向心肌样细胞直接转分化的潜力。肖祥等[20]报道，miRNA-1和心肌梗死后心肌缺血程度存在显著相关。上述研究表明，miRNA-1表达在心肺复苏后心脏功能障碍中发挥重要作用。
综上所述，心肺复苏后心肌发生明显的细胞凋亡，miRNA-1参与了心肺复苏后心肌细胞凋亡的发生和发展，与心功能障碍严重程度密切相关，其具体途径可能是通过调节靶基因从而促进或抑制靶基因蛋白表达而实现。
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（收稿日期：2016-11-16）