1.杭州市肿瘤医院，浙江杭州 310002；2.中国医学科学院 北京协和医学院 放射医学研究所 天津分子核医学重点实验室，
天津 300192
[摘要] 目的 观察17a α-D-高炔雌二醇-3-乙酯（DHEA）联合放、化疗对EC109食管癌移植小鼠的抑制作用及放化疗对荷瘤小鼠造血系统的防护作用。 方法 每只小鼠右侧腋窝下接种0.1 mL EC109细胞悬液，接种当天计为第1天。在接种后3 d，将30只接种EC109的裸鼠随机分为对照组、照射组、5-Fu组（25 mg/kg）、DHEA组、DHEA联合照射组、DHEA联合5-Fu组，每组5只。DHEA按照7.5 mg/kg剂量腹腔注射给药，0.2 mL/只，1次/d，连续9 d共给药9次。分别于第4天和第8天对照射组及DHEA联合照射组小鼠的肿瘤进行2 Gy局部照射。5-Fu按照25 mg/kg的剂量进行腹腔注射，0.2 mL/只，隔日1次，共给药4次。12 d后分别检测肿瘤抑制率、外周血细胞数、骨髓有核细胞数等指标。 结果 DHEA、DHEA联合照射组及DHEA联合化疗组瘤重均显著低于对照组[（0.34±0.02）g、（0.30±0.02）g、（0.23±0.02）g比（0.90±0.02）g，P < 0.01]，DHEA联合照射组瘤重低于单照组[（0.30±0.02）g比（0.70±0.03）g，P < 0.05）]。DHEA、DHEA联合照射及DHEA联合化疗组单个核细胞数均高于照射组[（18.3±1.7）×106、（19.3±0.5）×106、（19.2±2.0）×106比（9.4±2.4）×106，P < 0.05]。 结论 DHEA联合照射或化疗对食管癌移植小鼠具有较好的协同抗瘤效果，DHEA对照射和化疗后荷瘤小鼠造血系统具有一定的防护作用。
[关键词] DHEA；辐射；5-氟尿嘧啶；食管癌；BALB/c-nu小鼠
[中图分类号] R811.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）11（b）-0004-04
The antitumor effects of DHEA combined with radiotherapy and chemotherapy on human esophageal transplanted carcinoma in nude mice
WANG Xinyan1 WANG Yueying2 WU Hongying2 LU Lu2 ZHANG Junling2 MENG Aimin2 LI Deguan2
1.Hangzhou Cancer Hospital， Zhejing Province， Hangzhou 310002， China； 2.Institute of Radiation Medicine， Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College Tianjin Key Laboratory of Molecular Nuclear Medicine， Tianjin 300192， China
[Abstract] Objective To observe the antitumor effects of 17-a-D-homo ethynyclestradiol-3-accetate （DHEA） combined with radiotherapy or chemotherapy and protective effect of DHEA on hematopoietic function in tumor-bearing nude mice. Methods EC109 cell suspension were vaccinated by 0.1 mL per mouse right armpit， the day of the first vaccination was selected to day 1. The EC109-inoculated nude mice of 30 were divided into six treatment groups as control， irradiation， fluorouracil （5-Fu）， DHEA， DHEA combined with irradiation and DHEA combined with 5-Fu. The groups with DHEA were continuously delivered drugs for 9 days， with 0.2 mL/each，1 time/d， the groups with 5-Fu were injected in fourth and eighth day， the group with irradiation were given 2 Gy twice. 5 - Fu intraperitoneal were injected in accordance with the dose of 25 mg/kg， 0.2 mL/each， day 1， a total of dosing was four times. the tumor inhibition rate， the number of peripheral blood cells， bone marrow nucleated cell count were detected after 12 d. Results The results showed that tumor weight in DHEA [（0.34±0.02） g]， DHEA combined with irradiation [（0.30±0.02） g] or 5-Fu [（0.23±0.02） g] mice were all significantly lower than those of control group [（0.90±0.02） g] （P < 0.01）； the tumor weight in DHEA combined with irradiation group [（0.30±0.02） g] was lower than that of irradiation group [（0.70±0.03） g] （P < 0.05）. The BMNC cells in DHEA [（18.3±1.7） ×106]， DHEA combined with irradiation [（19.3±0.5） ×106] or 5-Fu [（19.2±2.0） ×106] group were all significantly higher than those of irradiated group [（9.4±2.4） ×106] （P < 0.05）. Conclusion DHEA combined with irradiation or 5-Fu shows synergic effect on EC109-inoculated nude mice and protectes hematopoietic system from irradiation injury.
[Key words] DHEA； Irradiation； Fluorouracil； Esophageal cancer； BALB/c nude mice
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目（编号81102873）；天津市应用基础及前沿技术研究计划（青年基金项目）（编号12JCQNJC09100）。
通讯作者
随着经济发展，恶性肿瘤已升至我国疾病病死率第2位，仅次于脑血管病。现在临床肿瘤治疗主要以手术结合放、化疗等辅助治疗手段。在放、化疗过程中会损伤患者的免疫及造血功能，进而影响预后。提高肿瘤患者的免疫和造血功能，减轻毒副作用一直是肿瘤放、化疗亟需解决的问题[1]。17a α-D-高炔雌二醇-3-乙酯（DHEA）是一种新型辐射防护剂，本实验依据我国一类新药审批的要求[2]，建立了食管癌EC109裸鼠移植模型。在此基础上观察单独使用DHEA、DHEA联合照射或者化疗对荷瘤小鼠的作用，为DHEA作为肿瘤治疗辅助用药提供新的实验基础。
1 材料与方法
1.1 动物和细胞系
BALB/c-nu裸鼠30只，8～12周龄，雄性，体重20～22 g，购买自中国医学科学院动物所，许可证号为SCXK（2009-0004）。
1.2 药物和仪器
DHEA是放射所合成的雌激素类辐射防护剂，白色粉末，无味。5-氟尿嘧啶注射液（5-Fu），购买自天津金耀氨基酸有限公司。Leica切片机（德国，LM2235），全自动血液分析仪（日本sysmex，poch-100i），奥林巴斯显微镜（日本，BX51）电子天平（梅特勒一托利多仪器有限公司）。137Cs γ射线照射源（加拿大原子能有限公司，Autocell40），剂量率为0.75 Gy/min。
1.3 EC109荷瘤小鼠模型的建立
收集处于对数生长期的EC109细胞，调整细胞浓度为1×107/mL。每只小鼠右侧腋窝下接种0.1 mL细胞悬液，并将接种当天计为第1天。
1.4 分组及给药
在接种后3天，将30只接种EC109的裸鼠随机分为对照组、照射组、5-Fu组（25 mg/kg）、DHEA组、DHEA联合照射组、DHEA联合5-Fu组，每组5只。DHEA按照7.5 mg/kg剂量腹腔注射给药，0.2 mL/只，1次/d，连续9 d共给药9次。分别于第4天和第8天对照射组及DHEA联合照射组小鼠的肿瘤进行2 Gy局部照射。5-Fu按照25 mg/kg的剂量进行腹腔注射，0.2 mL/只，隔日1次，共给药4次。
1.5 外周血细胞计数
在第12天，摘除小鼠眼球取血，K3EDTA抗凝，全自动血液分析仪计数。处死荷瘤小鼠取瘤体进行称重，按照公式抑瘤率（%）=（1-治疗组平均瘤质量/对照组平均瘤质量）×100%来计算抑瘤率。取单侧股骨，用1 mL PBS冲洗骨髓，得细胞悬液后用全自动血液分析仪计数。
1.6 病理学HE染色
取小鼠肿瘤组织后，4%甲醛溶液固定，随后脱水后石蜡包埋。将石蜡块用切片机切片后进行HE染色，中性树脂封片后，用显微镜观察并采集图像。
1.7 统计学方法
采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 DHEA对小鼠移植瘤的作用
与对照组相比，DHEA及DHEA联合照射组、5-Fu及DHEA联合5-Fu组瘤重均显著降低（P < 0.01），与单纯照射组相比，DHEA联合照射组瘤重下降，差异有统计学意义（P < 0.05）。DHEA联合5-Fu组瘤重低于单纯5-Fu组，两组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。照射组瘤重低于对照组，但与对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），提示DHEA联合照射组有较强的抑瘤作用。结果见表1。
表1 DHEA联合放、化疗对小鼠食管癌的抑制作用（x±s，n = 5）
注：与对照组比较，**P < 0.01；与照射组比较，▲P < 0.05；DHEA：17a α-D-高炔雌二醇-3-乙酯；5-Fu：5-氟尿嘧啶
2.2 DHEA对荷瘤小鼠外周血细胞及单个核细胞的影响
与对照组比较，DHEA及DHEA联合照射组、5-Fu及DHEA联合5-Fu组的单个核细胞数均显著升高（P < 0.05）。与照射组比较，DHEA联合照射组白细胞数（WBC）和红细胞（RBC）均显著升高（P < 0.05），DHEA联合照射组的血红蛋白（HGB）也有升高（P < 0.01）。与对照组相比，DHEA及DHEA联合照射组、5-Fu组及DHEA联合5-Fu组的WBC、RBC、HGB数量均有所升高，但差异无统计学意义（P > 0.05）。结果见表2。
表2 DHEA联合放、化疗对荷瘤鼠外周血及单个核细胞的影响
（x±s，n = 5）
注：与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与照射组比较，▲P < 0.05，▲▲P < 0.01；DHEA：17a α-D-高炔雌二醇-3-乙酯；5-Fu：5-氟尿嘧啶；WBC：白细胞；RBC：红细胞；HGB：血红蛋白；PLT：血小板
2.3 肿瘤病理结果
小鼠肿瘤取出后，常规脱水固定，HE结果见图1。图1A为对照组肿瘤切片染色结果，表明对照组肿瘤形态不规则，未见规则结构。肿瘤外侧无包膜，与正常组织间无明显界限，呈浸润性生长。细胞呈强嗜碱性蓝染，为典型恶性特征。肿瘤细胞排列紊乱，大小不一，核异型明显，核浆比值增大，见核分裂相，核仁可见，中-低分化。照射组（图1B）肿瘤形态不一，细胞异型性明显，外侧无包膜，但与正常组织界限明显。肿瘤内有片状坏死，多见细胞凋亡，核分裂像少见。表明照射可诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长。而在DHEA组小鼠（图1C），肿瘤细胞坏死明显增多，存在组织细胞机化，与正常组织界限明显。核分裂相少见，核浆比值增大，核仁少见。图1D为DHEA联合照射组，图中可见肿瘤细胞生长被明显抑制，具体表现为细胞形态规则，瘤内有正常细胞，外侧有包膜，与正常组织界限明显。肿瘤细胞大小均一，形态较规则，核浆比值增大，核分裂相少见，核仁少见，高-中分化。5-Fu组（图1E）肿瘤形态规则，细胞呈索状排列，瘤内有脂性空泡，与正常组织界限明显。细胞呈强嗜碱性蓝染，大小形态较规则，核分裂相少见，偶见巨细胞。图1F为DHEA联合5-Fu组，可见组织形态不规则，细胞异型性明显，外侧有包膜。细胞蓝染降低，大小形态不规则，呈现片状坏死，核仁不明显，核分裂相少见。
A：对照组；B：照射组；C：DHEA组；D：DHEA联合照射组；E：5-Fu组；F：DHEA联合5-Fu组；DHEA：17a α-D-高炔雌二醇-3-乙酯；5-Fu：5-氟尿嘧啶
图1 各组小鼠移植瘤的病理学检测（HE染色，100×）
3 讨论
食管癌是一种常见的消化道肿瘤，全世界每年有近30万人死于食管癌，我国每年死于食管癌人数约15万人[3-5]。目前临床对于食管癌早期诊断仍存在一些困难，大部分食管癌患者治疗时已是中晚期，自然病程仅6～8个月，因此放化疗成为食管癌临床治疗的主要手段[6-8]。
DHEA是放射所研制的炔雌醇类衍生物，前期研究表明DHEA对放化疗引起的造血免疫损伤具有预防和治疗效果，对小鼠多种肿瘤均有一定的抑制作用[9-11]。本实验利用荷瘤BALB/c-nu小鼠作为肿瘤模型，进一步观察DHEA对食管癌放、化疗效果的影响，探讨DHEA联合放、化疗治疗肿瘤的可能。
DHEA能显著提高对荷瘤小鼠EC109食管癌的放化疗损伤，抑制小鼠肿瘤生长，进而降低肿瘤生长速度，明显减轻瘤重。当DHEA与放化疗联合应用时，表明出良好的协同抗瘤效果，抑瘤率均高于照射组、化疗组和单独DHEA。对各组移植瘤进行病理分析发现，与对照组和照射组相比，DHEA联合照射组小鼠移植瘤组织与正常组织界限明显，细胞分化程度明显增高；与对照组和5-Fu组相比，DHEA联合5-Fu小鼠也有更好表现，提示DHEA联合照射或化疗对食管癌具有协同抗瘤效果。
在肿瘤发生发展过程中，肿瘤患者的免疫功能普遍低下，但当手术切除肿瘤，或放化疗后，免疫功能会进一步受损[12-15]。外周血象检测是常规的免疫检测指标。本实验检测了不同处理对荷瘤小鼠外周血象的影响。结果表明，与照射组相比，DHEA能显著提高荷瘤小鼠的WBC、RBC、PLT和单个核细胞计数，提示DHEA可以有效缓解受照荷瘤小鼠的外周血损伤，增强免疫功能。
总之，DHEA在抑制荷瘤小鼠食管癌细胞生长的基础上，还能够改善荷瘤小鼠造血功能，与放化疗联合表现出对移植小鼠肿瘤显著的协同抗瘤效果。本实验研究为DHEA在食管癌放化疗中的应用提供了新的实验依据。
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（收稿日期：2013-08-19 本文编辑：卫 轲）