摘要以乌龟的肠道为研究对象,先对乌龟肠道微生物进行分离、纯化,再进行抑菌试验,结果表明:乌龟肠道微生物对鱼病致病菌嗜水气单胞菌有明显的抑制作用,以为鱼病的生物治疗提供理论依据。
关键词乌龟;肠道微生物;抑菌;鱼病
中图分类号S942文献标识码A文章编号 1007-5739(2010)06-0323-01
乌龟学名金龟(Geoclemys reevesii),别称山龟、秦龟、草龟,属爬行纲龟科。乌龟肉、血、胆汁、腹甲可供药用,有滋阴、滋阳、补血、补肾、止血、健骨等功效[1-2];乌龟排泄物中含有尿酸、尿酶、酯酶、活性蛋白等物质[3-4]。目前国内外对乌龟的研究多集中在分类、生长条件方面,针对乌龟排泄物的研究还较少。笔者以乌龟肠道微生物为研究对象,探讨乌龟排泄物对常见鱼病的抑制作用,为龟鱼混养提供理论基础,以开发一条新型的鱼类生态养殖之路。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1研究对象。菌种:嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophi-la)、肠型点状产气单胞菌(Aeromonas punctata feintertinalis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、鲁克氏耶尔森菌(Yersinia ruckeri)、鱼害粘球菌(Myxococcus piscicoia)(由中国科学院武汉水生所提供)。乌龟:200~500 g的土龟,购自宣城特种养殖厂。
1.1.2试剂与器材。试剂:牛肉膏、蛋白胨、琼脂、NaCl、K2HPO4、NaOH、无菌水,焦性没食子酸等。器材:培养皿、接种针、试管、三角瓶、烧杯、吸管(均在121 ℃下灭菌30 min备用),以及灭菌锅、酒精灯、电炉、真空泵、显微镜、恒温培养箱、数码相机等。
1.2培养基的制备
1.2.1无菌水的配置:配置20mL无菌水10个三角瓶,4.5 mL无菌水20支试管备用。
1.2.2牛肉膏蛋白胨培养基的制备。称取牛肉膏3.0 g,蛋白胨10 g,NaCl 5.0 g,琼脂20.0 g,放入大烧杯中加蒸馏水至1 L,加热溶解,调pH值至7.0,补充蒸馏水至1 L,分装于三角瓶中,在121 ℃下灭菌30 min备用。
1.2.3普通培养基的制备。称取牛肉膏5g,蛋白胨10g,NaCl 2g,K2HPO4 5 g,琼脂20.0 g,放入大烧杯中加蒸馏水至1 L,加热溶解,调pH值至7.0,补充蒸馏水至l L,分装于三角瓶中,在121 ℃下灭菌30 min备用。
1.2.4制作菌种斜面。将牛肉膏蛋白胨培养基和普通培养基各制作20支斜面,然后将鱼病菌种接种于普通培养基斜面,各接3支。
1.3乌龟肠道微生物的分离和纯化
1.3.1解剖取肠。将乌龟体表用75%酒精擦拭消毒后,沿四周剪开,掀开龟壳,展现肠道,从距肛门1 cm处剪断,再往前3 cm处剪断,取约3 cm长的后肠,隔2 cm取约3 cm的长中肠,再隔2 cm取前肠,最后取尿囊分别放入装有20 mL的无菌水三角瓶中。
1.3.2接种纯化及培养。采用倾注法,吸0.5 mL肠液放入9 cm培养皿中,每种肠液重复4皿(好氧和厌氧培养各2皿),再向其中进行牛肉膏蛋白胨培养基倒平板,然后分别置于37 ℃恒温培养48 h和厌氧培养7 d,然后进行菌落计数。将上述菌种接种于斜面,各接2支,然后分别进行培养。其中厌氧培养方法如下:在带有活塞的干燥器内的底部,预先放入焦性没食子酸粉术20 g和斜放盛有200 mL 10%NaOH溶液的烧杯。将接种有0.5 mL肠液的培养皿放入干燥器内,在干燥器口上涂抹凡士林,密封后接通真空泵,抽气5 min,关闭活塞。轻轻摇动干燥器,使烧杯中的NaOH溶液倒入焦性没食子酸中,2种化学物质混合后发生吸氧反应,使干燥器中形成无氧的小环境[5]。
1.4抑菌试验
将每支鱼病菌种斜面和肠道菌种斜面分别用无菌水洗下,制成菌悬液,摇匀备用。将鱼病菌菌悬液分别加入45、50 ℃含70 mL普通培养基的三角瓶中,摇匀,备用。将不锈钢管摆放于已冷凝的培养基中。将肠道中分离的微生物制成菌悬液分别加入不同的0.25 mL钢管中,以无菌水作对照,再将其置于37 ℃恒温培养24 h。
1.5测定方法
依据王大耜的《细菌分类基础》和中科院微生物所写的《一般细菌常用鉴定方法》进行鉴定。好氧微生物培养后进行挑菌、纯化,直至形成纯菌株后取出,进行革兰氏染色并镜检。
2结果与分析
2.1肠道微生物分离纯化结果
通过对乌龟肠道4个样品进行微生物的分离、纯化,经鉴定优势菌群有肠杆菌属(Enterbacter)、埃希氏菌属(Esc-herichia)、极毛杆菌属(Pseudomas spp.)、球菌属(Streptoc-occus)、芽孢杆菌属(Bacillus);厌氧菌有革兰氏阴性球菌、杆菌,革兰氏阳性球菌、杆菌,厌氧消化链球菌,胃八叠球菌,四联消化链球菌,卵形瘤胃球菌等。在不同培养条件下,不同肠道的微生物菌数量如表1所示。
2.2抑菌试验结果
经培养后观察,含嗜水气单胞菌的培养基上有明显抑菌圈,其他没有明显的抑菌圈。表明乌龟肠道微生物对能引起鱼病的嗜水气单胞菌有明显的抑菌作用,由此说明乌龟
排泄物对鱼病有抑制作用。
3结论
该试验运用生物共生和相克的原理,利用乌龟的自然排泄物来抑制和杀灭水产品中的病菌。结果表明,乌龟排物对鱼病有一定的抑制作用,为鱼病的生物治疗提供了理论依据。但对龟鱼混养的可行性及以乌龟排泄物代替化学药物防治鱼病还需进一步研究。
4参考文献
[1] 江苏新医学院.中药大词典[M].上海:上海人民出版社,1997.
[2] 沈萍,范秀荣,李广武.微生物学试验[M].3版.北京:高等教育出版社,1996.
[3] 李能树,李进华,何火折,等.乌龟肠道微生物区系和排泄抗菌研究[J].安徽大学学报:自然科学版,2008(5):91-94.
[4] 陶勇,李进华,武廷章,等.乌龟尿液主要成分测定及其抑菌效果研究[J].生物学杂志,2005(6):41-43.[5] 刘荫国.抗菌素类药物在防治鱼病中的应用[J].农业科技与信息,1998(1):42.