摘要 [目的]研究广州市售水产品中副溶血弧菌和溶藻弧菌的耐药性情况。[方法]采用Kirby-Bauer纸片扩散法检测从水产品中分离的87株副溶血弧菌和118株溶藻弧菌对水产养殖业中常用的18种抗生素的耐药情况。[结果]水产品中的副溶血弧菌和溶藻弧菌均对万古霉素、克林霉素以及青霉素类抗生素有明显抗性，多重耐药比例达100%，溶藻弧菌的多重耐受现象较为突出。[结论] 广州市售水产品中的副溶血弧菌和溶藻弧菌具有多种抗生素抗性，且多重耐药情况突出。
关键词 副溶血弧菌；溶藻弧菌；耐药性；多重耐药
中图分类号 S948 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）28-0074-04
Abstract [Objective] To investigate the drug resistance of Vibrio parahemolytics and Vibrio alginolyticus in aquatic products from Guangzhou retail markets. [Method] KirbyBauer disk diffusion method was used to detect the antibiotic resistance of 87 isolates of V. parahemolytics and 118 isolates of V. alginolyticus in aquatic products to 18 kinds of antibiotics widely used in aquaculture industry. [Result] Both V. parahemolytics and V. alginolyticus were resistant to vancomycin， clindamycin and penicilins. All the isolates exhibited multidrug resistance， while V. alginolyticus isolates showed outstanding multiple antibiotic resistance. [Conclusion] V. parahemolytics and V. alginolyticus in aquatic products from Guangzhou retail markets were resistant to many kinds of antibiotics， they also exhibited complex multidrug resistance.
Key words Vibrio parahemolytics；Vibrio alginolyticus；Drug resistance；Multidrug resistance
副溶血弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐细菌，主要分布于海水、海底沉積物以及鱼、虾、贝类等海产品中，不仅是水产养殖业的重要病原菌，而且是人类主要的食源性致病菌之一[1-3]。我国是副溶血弧菌引发食物中毒的高发地区，由该病原菌感染引发的急性肠胃炎占细菌性食物中毒的首位，在某些沿海城市比例高达60%以上[4-5]。溶藻弧菌虽然是水生环境中的优势菌种，同样会引起水生动物感染，但其对人类的致病性不如副溶血弧菌强，属于条件致病菌。鉴于溶藻弧菌的致病性弱于霍乱弧菌、创伤弧菌和副溶血弧菌等典型弧菌病原菌，临床症状相对较轻，一般不会导致死亡，且目前尚未出现溶藻弧菌大规模暴发的疫情，因此对其致病性和耐药性的研究也相对薄弱[6-8]。
目前，水产养殖业中抗生素的过度使用问题日益严重。用药种类广、剂量大、频次高等问题不仅会造成不良的生态学效应，药物残留及药物的选择压力致使病原菌对抗生素的敏感性下降甚至消失，而且增加了防治水产病害的难度，其耐药性甚至可能发生转移，对人体健康构成进一步的威胁[9-12]。笔者针对从广州市售水产品中分离的87株副溶血弧菌和118株溶藻弧菌，选取水产养殖业中常用的18种抗生素进行药敏试验，旨在研究广州市售水产品分离的副溶血弧菌和溶藻弧菌的耐药性情况，以期为水产养殖过程中抗生素的合理规范应用提供指导，为弧菌耐药基因的定位和耐药机制的研究以及水产品的安全性评估提供参考资料。
1 材料与方法
1.1 试验菌株
药敏性测定标准质控菌株大肠杆菌ATCC 25922，由广东省出入境检验检疫局检验检疫技术中心食品实验室微生物部提供。87株副溶血弧菌和118株溶藻弧菌来自广州地区多个肉菜市场售卖的水产品，品类涵盖花螺、花甲、青口、沙甲、白贝、大头蛤、沙蛤、鲍鱼、扇贝、海瓜子、蛏子和贵妃蚌。
1.2 培养基及药敏纸片
用于培养弧菌的特异性培养基TCBS和用于药敏性试验的培养基MHA均购自北京陆桥技术股份有限公司；用于弧菌液体培养的3% NaCl碱性蛋白胨水购自青岛海博生物技术有限公司。药敏纸片的选择按照美国临床实验室标准化研究所（Clinical and laboratory standards institute，CLSI）推荐的肠杆菌药敏试验抗生素选择原则，结合我国水产养殖业抗生素使用特点，选择使用的18种抗生素及其剂量见表1。18种抗生素的Oxoid药敏纸片，购自华粤瑞科科学器材有限公司。
1.3 药敏试验
在TCBS培养基上活化副溶血弧菌和溶藻弧菌后，挑取单菌落接种于3% NaCl的TSB培养基中37 ℃过夜培养后，用生理盐水稀释菌液至浓度为0.5麦氏浊度，以无菌棉拭子蘸取稀释后的菌液，均匀涂布于4 mm厚的MHA平板上，操作过程严格按照美国临床实验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推荐的Kirby-Bauer纸片扩散法[13]进行。37 ℃下倒置培养16～18 h后，测量抑菌圈直径，再根据CLSI标准判定为耐药（resistant）、中介（intermediate）以及敏感（sensitive）。
2 结果与分析
2.1 副溶血弧菌分离株的药敏试验结果
由表2可知，水产品中的副溶血弧菌对抗生素的耐药现象相当普遍，87株副溶血弧菌都呈现出不同程度的抗生素抗性，其中最突出的是万古霉素，耐药率高达100%，其次是耐药率达到95.40%的克林霉素。此外，副溶血弧菌分离株对链霉素和青霉素类抗生素（如阿莫西林、氨苄西林）有明显抗性，耐药率均超过75%。通过比较副溶血弧菌分离株对不同抗生素的敏感程度可知，水产品中的副溶血弧菌对庆大霉素、四环素、复方新诺明、头孢哌酮和环丙沙星较为敏感。
2.2 溶藻弧菌分离株的药敏试验结果
由表3可知，水产品中的溶藻弧菌对抗生素的耐药现象更为普遍，118株溶藻弧菌分离株均对万古霉素和克林霉素有抗性，对阿莫西林、氨苄西林、羧苄西林等青霉素类抗生素的耐药率均在90%以上。此外，还对链霉素和头孢类抗生素（如头孢唑啉、头孢呋辛钠和头孢噻吩）有明显抗性，但对同属于头孢类抗生素的头孢哌酮则非常敏感。通过比较溶藻弧菌分离菌株对不同抗生素的敏感程度可知，水产品中的溶藻弧菌对头孢哌酮、环丙沙星、庆大霉素、四环素和复方新诺明较为敏感，与副溶血弧菌分离株基本一致。
2.3 副溶血弧菌分离株的多重耐药情况及相关耐药谱分析
87株副溶血弧菌分离株均存在多重耐药情况，有4株副溶血弧菌对多达9种抗生素具有抗性，多重耐药菌株的比例见图1。其中60%以上的菌株同时对6种及以上的抗生素具有抗性，这55个菌株的多重耐药谱见表4。
2.4 溶藻弧菌分离株的多重耐药情况及相关耐药谱分析
118株溶藻弧菌分离株均存在多重耐药情况，且多重耐药情况比副溶血弧菌更为严重，有5株溶藻弧菌对多达12种抗生素具有抗性，溶藻弧菌分离株的多重耐药菌株的比例见图2。其中，75%以上的菌株同时对9种及以上的抗生素具有抗性，这90个菌株的多重耐药谱见表5。
3 结论与讨论
笔者选取水产养殖业中常用的18种抗生素，采用Kirby-Bauer纸片扩散法研究从广州市售水产品分离的87株副溶血弧菌和118株溶藻弧菌的耐药性情况，发现这2种弧菌对抗生素的耐药现象相当普遍，所有菌株都呈现出不同程度的抗生素抗性，而且多重耐药情况十分突出，达到100%，溶藻弧菌的多重耐药情况尤为严重。通过分析这些弧菌分离株的耐药情况，整理出典型菌株的多重耐药谱，可为水产养殖过程中抗生素的合理规范使用提供有效指导，有利于水产养殖业的可持续健康发展。此外，通过试验获得的耐药性研究结果对于掌握水产品中的副溶血弧菌和溶藻弧菌的耐药现状及风险评估具有重要的现实意义，并为副溶血弧菌和溶藻弧菌耐药基因定位和耐药机制的研究提供参考资料。
Kirby-Bauer纸片扩散法是一种定性测定细菌耐药性的方法，由于其具有操作简单，价格便宜，不需要专门的仪器设备，而且形成了标准化、规范化的操作流程等优势，目前已广泛应用于各种细菌耐药性的研究。但是，应注意此方法的试验结果受细菌接种量、药敏纸片质量、培养基的成分与厚度、具体试验操作等因素的影响，只有严格按照CLSI的标准执行才能有效减少这些因素对试验结果的影响，避免假性耐药和假性敏感情况的出现。
该研究发现，副溶血弧菌和溶藻弧菌分离株具有多重耐药性。与国内外同类数据对比，笔者调查的广州地区副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重耐药情况更为突出和集中[14-16]。副溶血弧菌和溶藻弧菌作為水产养殖业中的主要病原菌，在水产养殖过程中投放的抗生素其抗菌谱大多数会覆盖这2种弧菌，从而促使这2种弧菌在反复接触这些抗生素后逐步形成抵御抗生素作用的能力，产生对多种抗生素不同程度的抗性，形成了这种多药耐受局面[10，12]。此外，细菌间耐药质粒的水平迁移也有可能加剧水产品中副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重耐药情况。耐药质粒可以通过接合、转导等途径在弧菌之间传播，使敏感菌株获得耐药基因，从而产生抗生素抗性，实现弧菌耐药性的传播[17]。
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