【摘 要】目的：研究miR-25不同表达水平对食管癌细胞系KYSE-150、EC109侵袭转移能力的不同影响并且探讨这种差别对临床工作的指导意义。方法：将miR-25模拟物、抑制剂、以及阴性对照转染入食管癌细胞系KYSE-150及EC109，使miR-25在两个细胞系中过表达及表达抑制；qRT-PCR法检测转染后不同组miR-25的表达情况；然后进一步通过Transwell细胞迁移实验、细胞侵袭实验研究miR-25对两个细胞系侵袭转移能力的影响。结果：miR-25过表达促进食管癌细胞系KYSE-150及EC109的侵袭转移，抑制miR-25表达后KYSE-150的侵袭转移能力明显被抑制，而EC109的侵袭转移能力变化不明显。结论：miR-25促进食管鳞癌细胞的侵袭转移，抑制miR-25对不同食管鳞癌细胞侵袭转移能力影响不同。
【关键词】食管癌/食管恶性肿瘤 microRNA25/miR-25 侵袭 转移
【Abstract】Objective： To investigate the different roles miR-25 play in invasion and metastasis of EC109 and KYSE150. Methods： To inhibit and overexpress miR-25 by transfecting miRNA inhibitor and miRNA mimic into human esophageal carcinoma cells KYSE150 and EC109， then study the function miR-25 plays in different groups of cells through Transwell migration assay and Transwell invasion assay， finally analyse the data of different groups. Results： Overexpressing miR-25 by miRNA mimic led to increased cell migration and invasion in both KYSE150 and EC109； supressing miR-25 resulted in decreased cell migration and invasion in KYSE150， whereas the difference wasn’t obvious in EC109. Conclusion： miR-25 promotes invasion and metastasis of esophageal squmous cancer， inhibitting miR-25 may have different influence in different kind of cells.
【Keywords】esophageal； cancer/carcinoma； invasion； migration
一直以来食管癌是威胁世界人民生命健康的一大因素，其在世界范围内的发病率和死亡率分别位于第八位和第六位。而我国处于食管癌高发区，发病率和死亡率居高不下，在国内所有食管癌病理类型中90%属于食管鳞状细胞癌[1]，这与早期食管癌难以识别以致延误治疗有很大关系。所以发现识别早期食管癌的分子机制及标记物是我们面临的巨大挑战，并且对于临床靶向、个体化治疗以及患者预后有着重要意义。
MicroRNAs （miRs）是近年来发现的一类长度约22个核苷酸序列的非编码小分子RNA，它通过促使靶mRNA降解或抑制其翻译来调节靶基因的表达，在细胞的分化增殖和凋亡，个体发育，机体代谢及免疫调节中都具有重要的作用[2]，研究发现人类肿瘤细胞和肿瘤组织内miRNA的表达水平和类型都与正常细胞和正常组织的miRNA表达水平明显不同，并且已发现的人类miRNA大部分位于已知的肿瘤相关基因组区域内或已知的基因脆性位点[3]，这些都提示miRNA可能与肿瘤的发生有着密切的联系，因此研究与肿瘤相关的miRNA分子机制将有助于理解肿瘤的发生发展过程，并有可能成为诊断肿瘤的潜在生物分子标记用来协助临床实践。
现已发现多种miRNA与肿瘤存在密切的联系，Calin发现miR-15和miR-16基因在约68%的慢性淋巴细胞白血病病例中发生缺失或下调[3]， miR-197、miR-346在滤泡性甲状腺癌，miR-221、 miR-222、 miR-181b在乳突状甲状腺癌中均呈高表达。MiR-25是miR-106b-25多顺反子的一部分，位于染色体7q22.1上MCM7基因的第13个内含子区，Petrocca等研究发现miR-106b-25 簇（miR-106b、miR-25、miR-93）在胃癌细胞中高表达[3]，Kan等发现，miR-106b-25多顺反子在体外具有潜在的促进增殖拮抗凋亡促进细胞周期的作用，在体内有致瘤性，在肿瘤形成过程中逐渐上调，并与MCM7基因扩增和过表达相关，miR-25通过靶向和抑制Bim，参与食管肿瘤的形成和增殖[4]。然而目前为止对于miR-25与食管癌侵袭与转移的研究还很少。也鲜有文献报道miR-25的表达水平对不同食管癌细胞系侵袭转移能力的影响差别，由于相同肿瘤不同细胞系间的细胞生物学特性也不尽相同，如增殖、迁移、成瘤，以及基因变化等方面可能存在差异，所以相同的实验处理可能会带来不同的实验效果。本研究一方面探讨miR-25表达水平对食管癌细胞系KYSE-150及EC109侵袭转移能力的影响，一方面比较这种影响在两种细胞系间的差别，为后续的实验提供研究基础。
1 材料和方法
1.1 细胞系
人食管鳞癌细胞系KYSE150及EC109购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所。
1.2 试剂
细胞中RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、定量试剂盒、Mir-25-3p定量检测引物、U6内参定量检测引物、MicroRNA的模拟物及抑制剂、转染试剂、转染实验的阴性对照及阳性对照、靶基因β-actin内参引物均购自新疆贝思汀生物科技有限公司。
1.3 细胞培养
所有细胞均为RPMI-1640培养基（Gibco， USA）加10%胎牛血清（Invitrogen， Carlsbad， USA），于37℃含5%CO2的培养箱中培养。
1.4 细胞转染
将两个细胞系KYSE-150和EC109分别分为三组（mimic组、inhibitor组及control组）接种于六孔板中，采用新疆贝思汀生物科技有限公司的Hiperfect transfection reagent进行细胞转染，操作按照说明书进行。
1.5 总RNA的提取、逆转录及实时荧光定量PCR。（全过程注意无酶环境）
按照试剂盒miRNeasy Mini Kit （Qiagen， Germany）说明书操作步骤提取细胞总RNA，紫外分光光度仪测定总RNA浓度与纯度，使A260/A280值在1.8-2.0。根据试剂盒miScript Ⅱ Reverse Transcription Kit （Qiagen， Germany）说明书操作步骤进行逆转录，根据试剂盒miScript SYBR Green PCR Kit （Qiagen， Germany）说明书操作步骤采用实时荧光定量-PCR（RT-qPCR）检测miR-25水平，每组实验至少重复3次。选择miR-U6为内参，应用2-ΔΔCt方法计算目的基因相对表达水平。
1.6 Transwell细胞迁移实验及细胞侵袭实验 1）细胞迁移实验
实验前一天将细胞在无血清培养基中饥饿培养，然后分组进行转染，将分组转染后24h的细胞消化并调整细胞浓度后接种到Transwell小室上室中，下室以胎牛血清作为趋化因子，接种后将24孔板置于37℃，5%CO2的培养箱中孵育，24h后取出小室，细胞固定、染色、计数，下室中细胞镜下观察分视野计数。2）细胞侵袭实验 同细胞迁移实验流程相似，不同的是Transwell小室内加入Matrigel胶（Coring Matrigel Basement Membrane Matrix）。
2 数据分析
采用SPSS20.0对数据进行统计学分析，所有数据以均数±标准差的形式表示，两组间的差异比较采用t检验，检验结果p<0.05为具有统计学意义。
3 结果
3.1 转染后miR-25在两个细胞系中的表达情况
为了研究miR-25的表达水平对食管癌细胞系生物特性的影响，人为转染mir-25模拟物、抑制剂以及阴性对照试剂，造成KYSE-150细胞中miR-25的不同表达，采用qRT-PCR检测两个细胞系中三组细胞的miR-25表达情况，结果见图1A.1B.。KYSE-150细胞系中mimic组与阴性对照组表达有差异，mimic组miR-25的表达明显高于阴性对照组（p=0.001），而inhibitor组miR-25的表达明显低于阴性对照组（p=0.007）；EC109细胞系中mimic组与阴性对照间表达也有差异，mimic组miR-25的表达明显高于阴性对照组（p=0.027），inhibitor组miR-25的表达明显低于阴性对照组（p=0.007）。
3.2 miR-25对食管癌细胞系KYSE-150及EC109的侵袭转移能力的影响有差别
Transell细胞迁移、侵袭实验显示，KYSE-150细胞系经转染后mimic组穿膜细胞的数量明显多于阴性对照组，inhibitor组则是相对阴性对照组明显减少，差异均具有统计学意义（p<0.05）；EC109细胞系经转染后mimic组穿膜细胞的数量明显多于阴性对照组（p<0.05），而inhibitor组细胞相对阴性对照组无明显减少，两者差异无统计学意义（迁移实验p=0.690；侵袭实验p=0.809）见图2.A，2.B及图3.A，3.B。
4 讨论
食管鳞状细胞癌是起源于食管上皮组织的恶性肿瘤，其在全球的发病率和死亡率存在地域差别，而且男性患食管癌的风险高于女性[5]，这一致死性的疾病严重影响着人们的生命与生活质量。我国是食管鳞癌的高发国家，虽然随着医疗科技的不断发展，其死亡率有所下降，但在我国食管鳞癌的诊断与治疗仍然形势严峻，患者在接受传统治疗（外科手术、放射治疗、化学抗癌药物治疗）后癌症病情仍会恶化。这与早期食管鳞癌难以识别以致延误治疗有很大关系，另外，癌细胞的侵袭转移能力也是影响患者预后的重要因素。侵袭与转移是多步骤的生物学过程，包括：细胞粘附、迁移、血管发生、免疫逃逸和靶器官定植。所以发现辨识早期食管癌的分子标志并在此基础上研究出更加精准的治疗方法是医学科研工作者的当务之急。
有研究表明miR-106b-25多顺反子具有致癌性，其在肿瘤形成的过程中表达升高[6]，另有研究发现miR-25， miR-106b， miR-21， miR-203和miR-145在食管鳞状细胞癌中的表达明显不同于正常组织[7]，KimBH等人证实了miR-25与胃癌的淋巴结转移相关[3]。既然miR-25在食管鳞状细胞癌中也是高表达，那么我们推测其在食管鳞状细胞癌的形成发展过程中也起到至关重要的作用，本研究就miR-25在不同食管鳞癌细胞系KYSE-150和EC109中的不同表达水平对食管鳞癌细胞侵袭转移的影响做了进一步的探讨。我们通过转染miRNA模拟物、抑制剂及阴性对照成功使miR-25在两个细胞系的三组细胞中表达有差异，然后对不同组细胞检测食管癌细胞侵袭转移能力，结果显示miR-25的过表达及抑制对食管鳞癌细胞系KYSE-150的侵袭转移都具有明显影响，过表达后可明显促进细胞的侵袭转移能力，抑制后则显著降低细胞的侵袭转移能力；然而EC109的结果却与此有所不同，过表达miR-25后同样可以促进细胞的侵袭转移，抑制miR-25后EC109细胞系没有表现出明显变化，其侵袭转移能力没有受到明显影响，说明miR-25确实可以促进食管癌细胞的侵袭转移能力，但就不同分化程度的癌细胞而言其作用效果不同。这对于以后的体外细胞实验具有一定的指导意义。
体外培养的细胞是一种在特定条件下生长的细胞群体，它们保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，具有相应理化和生物因素刺激的应答反应，对研究人类相关的组织器官的生物学性状及相关疾病的发生机制有重要意义。本研究中使用的KYSE-150属于低分化食管鳞状细胞癌，而EC109属于高分化食管鳞状细胞癌，实验结果提示我们miR-25对低分化食管癌细胞的侵袭转移力的影响有可能高于高分化食管癌细胞。众所周知，分化程度越低的癌细胞越可能具有较强的侵袭转移能力，如果miR-25是影响其侵袭转移的关键分子，就为我们将来针对每一位患者的精准医疗提供了有意义的治疗靶向。虽然说miR-25在食管鳞状细胞癌中起到致癌基因的作用，且实验证实其能促进食管鳞癌的侵袭转移，但是抑制其表达后对高分化食管鳞癌的侵袭转移影响不大，这就提醒我们，miR-25在诊断食管癌、判断病情的进展程度和患者预后中具有一定的意义，但如果涉及未来的靶向治疗或精准医疗治疗食管癌的话，就要另当别论，个体化对待了。
参考文献：
[1] Jemal A， Bray F， Center MM， et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin， 2011， 61（2）： 69-90.
[2] Doerks T. Control of translation and mRNA degradation by miRNAs and siRNAs. Genome Res， 2002， 12（1）： 47-56.
[3] Calin GA， Sevignani C， Dumitru CD， et al. Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. Proc Natl Acad Sci U S A， 2004， 101（9）： 2999-3004.
[4] Kan TMeltzer SJ. MicroRNAs in Barrett"s esophagus and esophageal adenocarcinoma. Curr Opin Pharmacol， 2009， 9（6）： 727-732.
[5] Guo Y， Chen Z， Zhang L ZF， et al. Distinctive microRNA profiles relating to patient survival in esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Res， 2008， 68（1）： 26-33.
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[7] Andrew Feber P， Liqiang Xi， James D. et al. MicroRNA Expression Profiles of Esophageal Cancer. J Thorac Cardiovasc Surg， 2008， 135（2）： 255-260.