摘要：为研究生物制剂芽孢杆菌A、芽孢杆菌B、芽孢杆菌C、芽孢杆菌D（未定种）、壳寡糖及激活蛋白对柑橘贮藏的防腐及保鲜效果，以温州蜜柑为试材，设计了6个生物制剂处理，以化学药剂咪鲜胺乳油与百可得可湿性粉剂混配为阳性对照，以清水为空白对照，浸果后入通风库及冷库贮藏。结果表明，两种贮藏条件下，生物制剂中芽孢杆菌B及壳寡糖处理贮藏防腐及保鲜效果均较好，两者冷库贮藏效果优于通风库贮藏，防腐效果可与化学药剂处理相当，且贮藏效果最佳时间为30～45 d，品质保鲜效果均优于化学药剂处理。通风库贮藏条件下，激活蛋白制剂处理的防腐效果优于冷库贮藏且与化学药剂处理相当。在温州蜜柑短期贮藏保鲜时，可采用芽孢杆菌B或壳寡糖处理，通风库贮藏可另选激活蛋白制剂处理。
关键词：柑橘；贮藏保鲜；芽孢杆菌；壳寡糖；激活蛋白
中图分类号： 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）23-4577-05
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.23.040
Abstract： To study the effect of several biological agents of Bacillus A/B/C/D（undetermined species），chitosan oligosaccharide and activator protein on preservation and quality maintenance of citrus，satsuma orange was selected and stored in the ventilated storage and cold storage after treated with 6 biological agents as the experimental group， chemical preservatives prochloraz EC mixed with iminoctadinetris albesilate WP as a positive control group，and water as a negative control group. The results indicated that，under the two storage conditions，the preservation and freshness maintenance effect of biologic agents bacillus B and chitosan oligosaccharide were optimal to other biologic agents and negative control， and their cold storage effect was better than ventilated storage with the preservation effect of both was basically equivalent to the chemical treatment，and the quality maintenance effect of both was better than that of chemical agent during the best storage period of 30～45 d.Under the condition of ventilation storage，the preservation effect of activator protein was better than that of cold storage and could be equivalent to chemical agents. This study has indicated that the biologic agents Bacillus B or chitosan oligosaccharide could be the new preservatives for satsuma orange short-term storage and fresh-keeping，and the activator protein could be another choice in the condition of ventilation storage.
Key words： citrus； preservation and freshness maintenance； Bacillus； chitosan oligosaccharide； activator protein
柑橘采后貯藏期极易感染致病菌，导致柑橘发病腐烂变质，常会造成严重的经济损失而制约柑橘产业的发展。目前控制柑橘贮藏期病害主要依赖化学杀菌剂，但长期大量使用化学杀菌剂易产生农药残留、污染环境，同时也将导致致病菌产生抗药性[1]，从而降低防治效果。研究并利用无毒无害无残留、绿色环保型的防腐保鲜剂，以逐步替代化学杀菌剂在柑橘上的使用，是柑橘采后贮藏保鲜面临的一项紧迫任务。因此，生物防腐保鲜剂近年来成为研究热点，本研究比较了几种生物制剂对柑橘贮藏期的防腐保鲜效果，旨在为筛选生物制剂替代化学杀菌剂提供参考。
1 材料与方法
1.1 药剂与材料
生物制剂：共6种，芽孢杆菌A/B/C/D（未定种）及壳寡糖制剂（由湖北省农业科学院生物农药工程研究中心提供）、激活蛋白制剂（中国农业科学院植保所提供）。化学药剂：450 g/L咪鲜胺乳油+40%百可得可湿性粉剂。
果实材料：温州蜜柑果实，采自宜都市土老憨生态农业集团柑橘基地（晴天一果两剪法采摘）。
1.2 方法
挑选大小均匀、成熟度一致、无病虫害、表面无机械损伤的果实，用生物制剂及化学药剂均匀浸果（以化学药剂作对照，清水为空白对照），浸泡1 min后取出，“发汗”2～3 d，单果包装后装入塑料筐，各处理果实分两份分别放入经消毒处理的冷库（T：5±1 ℃，RH：85%左右）及通风库（T：4～10 ℃，RH：65%～80%）贮藏。
本试验共设7个药剂处理（包括6个生物制剂处理及1个化学药剂对照），1个清水空白对照共8个处理，药剂处理方法见表1。每个处理随机取180个果子，设3个重复，每隔15 d观察果实有无腐烂，并统计腐烂率、病情指数及防病效果，每隔15 d随机取6个果实测定可溶性固形物、可滴定酸等生理指标。果实病情分级标准：0级，未发病；1级，轻度发病，病斑面积占柑橘表面积1/4以下；2级，中度发病，病斑面积占柑橘表面积1/4～1/2；3级，重度发病，病斑面积占柑橘表面积1/2以上。果实发病达到3级后，将其从果框中剔除，下次统计时将其计3级。
1.3 数据处理
腐烂率=腐烂个数/总果数×100%（单果腐烂面积超过25%按烂果计算）；病情指数=[Σ（各级病果数×各级代表值）/（调查总果数×最高级代表值）]×100%；相对防效=（清水对照腐烂率-药剂处理腐烂率）/清水对照腐烂率×100%；用手持数字糖度计测定可溶性固形物（TSS），重复3次，取平均值；采用酸碱滴定法测定可滴定酸（TA）；固酸比=可溶性固形物（TSS）/可滴定酸（TA）。采用Excel和SPSS软件进行试验数据统计分析，采用Duncan’s新复极差法进行多重比较（α=0.05）。
2 结果与分析
2.1 对温州蜜柑防腐效果的影响
2.1.1 通风库贮藏对果实防腐效果的影响 由表2分析可得，通风库贮藏15 d温州蜜柑果实出现腐烂，随后，各处理腐烂率不同程度增大，贮藏前期（15～30 d），处理1、处理2、处理5、处理6、处理7间腐烂率无显著差异，在贮藏30 d时各处理腐烂率（0.6%～6.7%）显著低于清水对照处理8（腐烂率达17.5%）；贮藏后期（45～60 d），处理1、处理2、处理6间腐烂率（9.2%～23.3%）无显著差异，高于化学对照处理7（2.8%～6.7%），显著低于清水对照处理8（42.5%～66.7%）。贮藏期间，各处理病情指数的变化趋势与烂果率表现相似。
从防腐效果可看出，在贮藏30 d，各处理相对防效最佳，处理1、处理2、处理5、处理6（相对防效61.9%～81.0%）与化学对照处理7（相对防效96.8%）间无显著差异。综合评价，生物制剂中处理6防效最好，贮藏期间相对防效77.5%～81.0%，与化学对照处理7相对防效88.9%～96.8%无显著差异，处理1和2的防效較好（贮藏30～45 d相对防效66.7%～72.5%）；处理5次之（贮藏30～45 d相对防效54.9%～61.9%）；处理3和4的防效最差，贮藏期间相对防效低于40%。
2.1.2 冷库贮藏对果实防腐效果的影响 由表3分析可得，冷库贮藏期间，各处理柑橘果实腐烂率、病情指数普遍低于通风库贮藏，相对防效在贮藏前期普遍高于通风库贮藏。冷库贮藏期间，各处理间果实腐烂率、病情指数的变化趋势及差异表现与通风库贮藏表现相似。处理5、处理7在冷库贮藏45 d开始腐烂，贮藏15～30 d期间，处理1、处理2、处理5（0%～2.5%）及化学对照处理7腐烂率（0%）无显著差异， 显著低于处理8（清水对照腐烂率3.3%～7.5%）。贮藏后期（45～60 d），处理2腐烂率（0.6%～2.2%）与化学处理7（0.6%～5.6%）无显著差异，但其在贮藏60 d时，病情指数高于化学对照处理7，低于清水对照处理8；处理1腐烂率及病情指数显著升高且与清水对照无差异；处理5在贮藏60 d时与清水对照无差异。贮藏期间，处理3、处理4、处理6与处理8（清水对照）的腐烂率及病情指数无显著差异。
从防腐效果综合评价，冷库贮藏条件下，生物制剂中处理2、处理5防腐效果最好，两者贮藏最佳期为30～45 d，相对防效84.6%～100.0%，与化学对照处理7（94.9%～100.0%）无显著差异，且贮藏期间处理2防效较处理1稳定（处理1贮藏60 d相对防效显著降低）；处理1防效次之，且贮藏前期防效（66.7%～75.0%）高于贮藏后期（38.4%～44.4%）；处理3、4、6防效最差，贮藏期间相对防效低于45%。
2.2 对温州蜜柑品质保鲜的影响
2.2.1 通风库贮藏对果实品质保鲜的影响 果实未处理前，可滴定酸含量为0.57%，可溶性固形物含量为10.3%，固酸比为18.2。可溶性固形物和可滴定酸含量变化的综合作用则反应在固酸比上，固酸比对柑橘果实风味和口感的形成具有重要作用。由表4分析可知，药剂处理后通风库贮藏期间各处理间果实的可滴定酸、可溶性固形物、固酸比有显著性差异。随着贮藏时间的延长，各处理果实可滴定酸含量呈降低的趋势，可溶性固形物含量呈波动变化趋势，固酸比呈升高的趋势。贮藏期间处理2和处理5固酸比整体高于其他处理，最佳贮藏期30 d时，处理5和处理2固酸比（22.4～24.7）显著高于其他处理，处理7、处理6、处理1固酸比（15.3～18.6）显著低于清水对照（21.3）。综合分析，处理2、处理5相对处理7、处理6、处理1对果实贮藏期品质具有较好的作用。
2.2.2 冷库贮藏对果实品质保鲜的影响 由表5分析可知，冷库贮藏条件下，各处理间柑橘果实可滴定酸、可溶性固形物及固酸比的变化趋势与通风库相似，贮藏期间处理6、处理5、处理2固酸比整体高于处理1、处理7、处理8，贮藏30 d时，处理6、处理5、处理2固酸比（22.2～26.4）显著高于其他处理，处理7、处理1固酸比（18.2～19.2）显著低于清水对照（21.7）。综合分析，冷库贮藏条件下，处理6、处理2、处理5相对处理7、处理1对贮藏期果实品质具有较好的保持作用。
3 讨论
利用6个生物制剂和1各化学药剂处理温州蜜柑果实，从通风库及冷库不同贮藏条件下各药剂的防腐效果及品质保鲜效果两方面综合分析，发现两种贮藏条件下生物制剂中芽孢杆菌B及壳寡糖防腐及保鲜效果均较好，两者冷库贮藏效果优于通风库贮藏，冷库贮藏30～45 d效果最佳，防腐效果可与化学药剂处理相当，且品质保鲜效果优于化学药剂处理；通风库贮藏条件下，激活蛋白制剂的防腐效果优于冷库贮藏且可与化学药剂处理相当，但其对品质保持无明显优势，通风库贮藏条件下可另选激活蛋白制剂作柑橘防腐保鲜处理。在温州蜜柑短期贮藏保鲜时，可采用芽孢杆菌B及壳寡糖处理，通风库贮藏可另选激活蛋白制剂处理。
芽孢杆菌属由于抗逆性强，具有在环境中易定殖、对人畜无害、不污染环境等优点，是应用于柑橘采后病害生物防治的一类重要拮抗微生物种类[2]。近年来有很多相关研究报道，如有研究发现芽孢杆菌RY3对柑橘绿霉病菌、青霉病菌及蒂腐病菌有较好的抑制作用[3]，本研究结果发现，芽孢杆菌B在柑橘采后贮藏防腐保鲜上有显著作用。另有研究发现芽孢杆菌B-912在较高温度下对柑橘病菌有抑制作用[4]，这与本研究中芽孢杆菌A在通风库贮藏条件下防腐效果优于冷库贮藏条件的结果基本相符。
壳寡糖是一种有效的植物诱抗激发子，壳寡糖免疫诱抗剂在病害防治上具有抑制病原菌的侵染和激发植物自生抗性等作用[5]。近年来壳寡糖对柑橘贮藏保鲜效果研究成为热点，有研究发现壳寡糖对柑橘酸腐病菌和黑腐病菌有抑制作用[6]。黄艳等[7]发现壳寡糖处理能明显降低柑橘果实炭疽病发病率。另有研究发现，壳寡糖不仅能起到杀菌作用，同时可以保持柑橘贮藏品质[8，9]，这与本研究结果相符。
激活蛋白是一类具有诱导植物抗病功能的蛋白激发子，是国际上已获得农药登记注册的植物免疫诱抗剂[5]，中国农业科学院植物保护研究所蛋白质药物工程组邱德文团队创制的激活蛋白免疫诱抗剂，对病毒病、细菌及真菌性病害都有明显的防治效果，且能提高作物产量及品质。且其团队研究证实激活蛋白能调节脐橙生长，防治脐橙病害，且其处理的脐橙果型好，果面光滑，可溶性固形物及产量均增加[10]。激活蛋白在果实采后病害防治上未见研究，本研究结果中激活蛋白处理的温州蜜柑果实在通风库贮藏条件下防病效果较好，在冷库贮藏条件下可溶性固形物含量及固酸比相对较高，对品质有较好的保持作用，在这两种贮藏条件下防腐保鲜效果的不稳定性需进一步研究。
百可得、咪鲜胺等是目前应用较多的柑橘贮藏保鲜化学杀菌剂，因两者防治柑橘贮藏期病害种类不同而常被混配使用。本研究室前期研究发现百可得与咪鲜胺混配后的贮藏期病害防治谱扩大，防腐效果好[11]，在本研究中将百可得与咪鲜胺混配作为化学对照处理，防腐效果较好，但品质保鲜效果不如生物制剂壳寡糖和芽孢杆菌B处理。在本研究调查过程中发现，此化学药剂处理组的温州蜜柑病果中都发现了青绿霉病果，分析可能是致病菌对此组化学药剂处理产生了抗药性所致，且已有研究证实，宜昌柑橘病原菌对咪鲜胺等化学杀菌剂已产生不同程度的抗药性[1]，因此研究新的防腐保鲜成分来应对抗药性，开发绿色、高效的柑橘防腐保鲜剂或方法，是未来柑橘采后病害防治保鲜的发展方向。
根据本试验结果，芽孢杆菌B及壳寡糖有望替代化学防腐保鲜剂，通风库贮藏可另选激活蛋白制剂替代化学防腐保鲜剂，但是生物制剂在两种贮藏条件下，在贮藏后期病情指数较化学药剂处理高，最佳贮藏期较化学药剂处理贮藏期短。后续研究生物制剂壳寡糖或芽孢杆菌B或激活蛋白可结合物理防治方法、低剂量化学杀菌剂和其他生物防治方法，如结合热处理[12]、结合抗病诱导剂如NaHCO3[12，13]或CaCl2[14]等、结合低剂量的化学杀菌剂[15]或拮抗微生物混合使用[16]、拮抗微生物（芽孢杆菌制剂）结合免疫诱抗剂（如壳寡糖、激活蛋白）等措施，互相弥补不足，发挥各自优势，提高生物制剂的防腐保鲜效果，延长贮藏保鲜期，同时减少化学杀菌剂的使用。
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