表面分子印迹技术在分离桂枝茯苓胶囊中PGG的应用

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分子印迹技术是对特定目标分子（即模板分子）制备具有高亲和性聚合物材料（molecularly imprinted polymer，MIP）的技术。MIP存在与模板分子空间结构互补，官能团相互作用（氢键、离子或范德华力等）的聚合物孔穴。MIP与模板分子的作用类似于酶和底物的结合，对模板分子具有较强的亲和性及识别能力^[8]。目前，分子印迹技术已在仿生传感、固相萃取、药物分析及膜分离等众多领域得到广泛应用^[9-11]，然而传统的分子印迹技术所制备的MIP存在粒径不均一、印迹分子包埋过深或过紧、解析率低等问题^[12];而表面分子印迹聚合物（surface molecularly imprinted polymer，SMIP）是在聚合过程中采取一定的措施，使功能单体与印迹分子在基质表面处聚合^[13-14]，因其识别位点固定在不同载体材料表面，恰好可以弥补上述不足^[15]，实现对印迹分子的快速再结合，已成为关注的热点。

本研究以硅胶为载体、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTS）为硅胶烷基化改性试剂、PGG为模板分子、甲基丙烯酸（MAA）为功能单体，制备了对PGG具有良好吸附性能的硅胶表面分子印迹聚合物，并以此为填料，实现了SMIP用于PGG大规模分离制备的可行性，为中药及复方活性成分的分离纯化及对照品的分离提供了一种新的思路和方法。

1材料

Agilent 1100型高效液相色谱仪（含两元泵、柱温箱、在线脱气机、VWD检测器）;AE240型电子分析天平（瑞士Mettler公司）;Milli-Q Academic纯水机（美国Millipore公司）;KQ-250DB型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）;ZYQ-211型恒温振荡器（东拓仪器制造有限公司）;Thermo Micro 17离心机（德国）。

PGG对照品（批号130815，自制，纯度98.2%）;桂枝茯苓胶囊（批号130201，江苏康缘药业股份有限公司）;硅胶（Silica beads， 62～105 μm， Sigma Aldrich， USA）;3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTS，纯度98%，上海阿拉丁试剂有限公司）;α-甲基丙烯酸（MAA，分析纯，国药集团化学试剂有限公司）;乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，分析纯，日本东京化成工业株式会社）;偶氮二异丁腈（AIBN，分析纯，上海研臣实业有限公司）;盐酸，甲苯，丙酮，甲醇，甲酸，冰乙酸，三乙胺（分析纯，南京化学试剂公司）;乙腈（色谱纯，Oceanpak，瑞典）;双蒸水（自制）。

2方法与结果

2.1色谱条件^[3]

Acuity C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）。梯度洗脱，0～5 min，5% A;5～20 min，5%～17% A;20～30 min，17%～19% A;30～40 min，19%～26% A;40～60 min，26%～88% A。流速1.0 mL·min-1，进样量10 μL，检测波长230 nm。

2.2PGG硅胶表面分子印迹聚合物的制备[16]

将硅胶150 g于3 mol·L-1盐酸溶液1 500 mL室温下搅拌24 h，抽滤后用双蒸水洗至中性，110 ℃干燥7 h，即得活化的硅胶。

取150 g活化硅胶于1 000 mL三颈圆底烧瓶中，加入甲苯300 mL，ATPS 300 mL，100 ℃下搅拌回流24 h。将反应后的硅胶过滤，经甲苯、丙酮、甲醇多次洗涤以除去残留的ATPS，50 ℃真空干燥5 h，得到氨基化硅胶。

称取氨基化硅胶120 g于1 000 mL三颈圆底烧瓶中，加入甲醇500 mL，室温下搅拌10 min，加入MAA 200 mL，在氮气保护下搅拌24 h，抽滤，依次用甲苯、丙酮、甲醇洗涤3次，50 ℃真空干燥5 h，得到功能单体化的硅胶。称取PGG 6 g 溶于甲醇100 mL中，加入到三口烧瓶中，加入乙腈300 mL，然后依次加入MAA 32 mol，EDMA 52 mol，AIBN 100 mg和功能化硅胶100 g，在氮气保护下60 ℃搅拌24 h，得反应产物。将反应产物减压过滤，依次用甲醇-醋酸（9∶1）、甲醇、甲醇-三乙胺（9∶1）、甲醇-醋酸（9∶1）、甲醇洗脱，以除去模板分子和未聚合的功能单体和交联剂，直至紫外检测无以上物质的紫外吸收，即得PGG的SMIP，50 ℃真空干燥，备用。

空白聚合物（non-surface molecularly imprinted polymer，SNIP）的制备除不加模板分子 PGG外，其余步骤同SMIP。

2.3静态吸附试验

分别称取30 mg 2.2项下的PGG SMIP和SNIP各6份，置于10 mL离心管中，分别依次加入4 mL不同质量浓度（5～60 mg·L^-1）的PGG-甲醇水溶液，密闭，混悬均匀，于室温下轻轻振摇20 h，离心取上清液，按2.1项下色谱条件检测溶液中模板分子PGG的浓度，根据吸附前后溶液中模板分子PGG的浓度变化计算分子印迹聚合物的吸附量（Qe），并进行Scatchard分析。结果见图1，2。

等温吸附曲线由SMIP（或SNIP）的吸附量对PGG-甲醇水溶液的平衡浓度作图而得（图1）。SMIP（或SNIP）对模板分子的静态平衡吸附量（Qe）可以用以下公式^[17]计算：Qe=（C0-Ce）V/W，其中Qe为静态平衡吸附量（mg·g-1），C0为溶液中PGG

的起始质量浓度（mg·L^-1），Ce为吸附平衡时PGG的质量浓度（mg·L^-1），V为溶液体积（L），W为印迹聚合物质量（g）。

从图1可以看出，SMIP对PGG的吸附量随PGG浓度增加而增加，当PGG质量浓度达60 mg·L^-1时，SMIP的吸附量为3.20 mg·g-1，而SNIP的吸附量为1.57 mg·g-1，说明SMIP对PGG的吸附能力明显高于其相应的SNIP。另外，随PGG浓度增加，SMIP与SNIP吸附量之差越来越大，说明在硅胶表面形成的2种聚合物的结构是不同的，分子印迹聚合物对目标分子具有选择性的吸附能力，而空白印迹聚合物不存在这种特异性的结合位点，因而吸附能力较差。

为了更加直观精确的评价SMIP的吸附性能，将SMIP与目标分子的结合量采用Scatchard方程进行分析，所用方程^[17]为Q/C=（Qmax-Q）/Kd，其中，Qmax为聚合物对目标分子吸附的最大表观结合位点数（mg·g-1）;C为目标分子的平衡质量浓度（mg·L^-1）;Kd为聚合物-目标分子复合物的解离常数（mg·L^-1）。根据实验数据， Q/C对Q呈有规律的曲线关系，同时在两端分别出现较好的线性部分（图2）。表明在本试验研究的浓度范围内，SMIP中存在着对PGG结合力不均匀的2类位点。对低质量浓度（C0<2.76 mg·g-1）的点进行线性拟合，得到Scatchard方程为Q/C=-0.023Q+0.155，聚合物中起主导作用的高亲和力结合位点的解离常数Kd=43.48 mg·L^-1，最大表观结合位点数为Qmax=6.74 mg·g-1;高质量浓度（C0>2.76 mg·g-1）时，Scatchard方程为Q/C=-0.083Q+0.323，其结合位点的Kd=12.05 mg·L^-1，Qmax=3.89 mg·g-1。事实上，SMIP对PGG的保留应是2类结合位点综合作用的结果，所以这种Scatchard分析存在一定的近似性。

2.4PGG的制备

2.4.1色谱柱的装填称取2.2项下PGG SMIP 85 g，装入空管柱中（30 mm×250 mm），然后用甲醇润湿，备用。

2.4.2桂枝茯苓胶囊提取物的制备取桂枝茯苓胶囊内容物100 g（含PGG 1.13%），研细，加甲醇搅拌回流提取2次（10倍/8倍量），2 h/1 h，滤过，合并2次滤液，减压浓缩，真空干燥，得到桂枝茯苓胶囊提取物32 g，备用。

2.4.3PGG的制备称取2.4.2项下的桂枝茯苓胶囊提取物24 g，用适量甲醇溶解（质量浓度约200 g·L-1），离心，取上清液，加载至2.4.1项下色谱柱，分次进样，每次进样5 mL，流速15 mL·min-1，先用1 200 mL甲醇冲洗，然后用甲醇-醋酸（9∶1）洗脱，分别收集洗脱液，其中，甲醇-醋酸（9∶1）洗脱液经氨水调pH至中性后，浓缩干燥得到PGG 0.41 g。

2.5质量分数测定

2.5.1对照品溶液的制备精密称取PGG对照品5.1 mg置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.5.2供试品溶液的制备精密称取2.4.3项下PGG样品5.2 mg至25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，1万 r·min-1离心5 min，取上清液，即得。

2.5.3样品测定分别吸取PGG对照品溶液和供试品溶液10 μL，按2.1项下色谱条件测定，用面积归一化法计算PGG质量分数为90.2%，保留时间38.711 min，色谱图见图3 （峰1为PGG）。

3讨论

中药及其复方是一个含有多种化学成分的复杂体系，如何从复杂体系中提取分离有效成分，是对其进行药效物质基础研究的重要问题，而传统的提取分离手段不仅耗时费力，且步骤繁琐，分子印迹技术作为近年来发展起来的一种新的分子识别技术，利用该技术制备的分子印迹聚合物相对于其他耗时、耗材的色谱法，具有制备过程简单、周期短、稳定性好、选择性好、消耗少等优点^[13]。

本研究应用表面分子印迹聚合物技术，制备了 PGG硅胶表面分子印迹聚合物，考察了高聚合物的吸附性能，并以此为填料自制色谱柱，对桂枝茯苓胶囊中PGG进行特异性的富集与分离，最终实现了PGG的大量高效制备，并利用分子印迹技术实现了复杂样品中PGG的一步富集纯化，此方法对于其他类似物质同样适用，这为分子印迹技术的应用奠定了基础，也为其他天然植物及中药复方活性成分的分离纯化提供了一种新思路。

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[责任编辑马超一]

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