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十全大补汤通过抑制肿瘤血管的形成影响肝癌生长的研究

时间:2022-10-22 15:25:03 来源:网友投稿

报告如下。

资料与方法

实验材料:①细胞株培养:在本研究张,我们使用的肿瘤细胞是小鼠肝癌CT-26细胞株,购于某实验动物研究所,合格证号SCXK(京)2004-0001,保存时采用液氮冷冻,以确保保存完好。在对细胞进行培养时,我们使用的培养基含有100mL/L胎牛血清(美国某公司)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基,培养温度采用的是37℃,并且要求环境含5%CO2和拥有饱和湿度条件,然后对细胞进行培养。②实验动物:在研究中,我们总共购买了BALB/c小鼠80只,鼠龄4~6周,雌鼠和雄鼠各有40支,平均体质量(18±2)g,购买自上海某公司,然后将小鼠分开饲养,在饲养过程中,都喂食基础饲料。③药物及试剂:十全大补汤由黄芪12g,肉桂3g,人参6g,茯苓9g,白术9g,炙甘草3g,熟地黄12g,白芍9g,川芎6g,当归9g组成,这些药物都是从福建某医院购买,其质量标准符合《中国药典》标准(2010年版)。药物买来后,先进行清洗,肉桂需要后下,而其他的药材首先需要加水浸泡0.5h,然后使用水煎煮2次,1.5h/次,对2次煎煮的滤液分别过滤保留,然后合并,最后浓缩成1mL含生药2g,随后将药物放入4℃冰箱进行保存,直至使用时再取出。用蒸馏水稀释,经0.22μm微孔滤膜过滤,配制成10mg/mL稀释液,实验用中药生药含量1.56g/mL。RPMI1640培养基小鼠血管内皮生长因子(VEGF)、血管抑素(AS)、内皮抑素(ES)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒、山羊抗小鼠CD34mAb、Ki67单克隆抗体工作液、超敏链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物连结法(SP)鼠试剂盒均为美国产品;末端脱氧核酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记(TUNEL)法试剂盒为德国产品。

实验方法:①小鼠肝癌模型的制作及分组给药:开始实验时,取对数生长期的小鼠肝癌细胞CT-26,然后配制成合适的浓度,使其混悬在PBS中,最终要制成单细胞悬液,配制完成后,使用台盼蓝对液体进行检测,检测活细胞数>95%。然后取0.2mL悬液(约含5×106个细胞),在严格遵守操作规程的基础上,把它接种于BALB/c小鼠右腋部皮下视作原发瘤。然后让肿瘤自然生长,当其体积达到500mm3左右时,将所有小鼠随机分为原发瘤切除组及十全大补汤组,每组中都含有10只小鼠。在原发瘤切除组,对该组的所有小鼠,我们均给予灌胃生理盐水0.4mL/d,而在十全大补汤组,对该组的所有小鼠,我们均给予灌胃十全大补汤0.4mL/d,两组的治疗时间都是10d,在治疗的过程中,分别在2、4、6、8、10d用卡钳法测定皮下肿瘤的大小并计算TV。计算公式:TV=(π/6)ab2,其中a、b分别表示瘤体的最大径和最小径。在治疗11d时,我们将小鼠的眼球摘除,然后取血,将小鼠处死,把体内的瘤体剥离,将剥离的瘤体放置在10%甲醛溶液中,放置48h后,对瘤体行常规石蜡包埋切片,倒置显微镜观察病理变化。②SP免疫组织化学染色观察CD34、Ki67表达:当蜡块制作完成后,我们将其取出,然后使用切片机将其切成4μm连续切片,切片完成后,使用二甲苯、梯度乙醇脱蜡水化,将切片依次经阻断灭活内源性过氧化物酶、0.01mol/L枸橼酸缓冲液抗原修复、正常血清封闭、抗体结合、3,3′-二氨基联苯胺(DAB)染色、蒸馏水洗涤,再经苏木素衬染,烟酸酒精分化,稀氨水蓝化,递增梯度乙醇脱水,二甲苯透明,常规树脂封片。在制作的过程中,用到的一抗是1:50稀释的山羊抗小鼠CD34mAb、Ki67单克隆抗体工作液,二抗是1:200生物素标记(针对Ki67的二抗为1:100快捷型酶标羊抗鼠IgG聚合物),显色时加入1:200辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液。当需要对微血管密度(MVD)进行检测时,我们使用的方法是Weidner法。制作完成后,我们对切片进行观察,如果发现血管内皮细胞的颜色变成棕色,则认为是CD34阳性。此外,我们还要对切片的血管分布情况进行观察,一般选择使用100倍光镜来进行观察,在观察的过程中,主要是要找到肿瘤区域内微血管分布密度最高的5个区域,然后将光镜调整为200倍,对不重复视野中被CD34染成棕黄色的微血管数进行详细的计数,对5个区域内的数量都需要仔细统计,然后求平均值作为MVD。在计数的过程中,需要注意计数原则,一般每个单独的血管内皮细胞,只要其呈阳性染色,都应该视为一个独立的微血管,如果它的结构不相连,那么分支结构在计数的过程中也应该视为一个独立的微血管。Ki67以细胞核染色呈棕褐色或棕黄色颗粒为阳性,在观察的过程中,一个切片选择10个高倍视野进行观察,然后计算视野中的Ki67标记指数(Ki671abelingindex,Ki67-LI)。③ELISA法检测血清中VEGF、AS、ES水平:在标本收集过程中,我们收集到小鼠眼球中的血液,然后将其取出,在10000×g离心10min,离心后,将上层的血清液收集待用,待标本都收集完成后,统一使用小鼠ELISA试剂盒测定各组小鼠血清VEGF、AS、ES表达情况,在操作的过程中,我们严格按照试剂盒的说明书进行操作,以保证实验结果的准确可靠,最后测定出其浓度值。

统计学方法:对本研究中所获得的所有数据资料,我们都使用SPSS 17.0统计软件包进行统计学分析和处理,对于数据中的计量资料,我们使用(x±s)表示,以P<0.05为具有统计学意义。

结果

十全大补汤对小鼠肝肿瘤生长的抑制作用:肝肿瘤模型各组小鼠初次接种CT-26细胞后7~10d皮下全部成瘤,肿瘤大小差异无统计学意义。各组小鼠治疗10d后,第11天,处死小鼠,游标卡尺测量肝肿瘤大小,十全大补汤组肿瘤体积明显低于生理盐水组(P<0.01),见图1。

十全大补汤抑制小鼠肝肿瘤增殖:各组小鼠治疗后肿瘤Ki67表达差异有统计学意义。肝肿瘤模型中,治疗后十全大补汤组细胞核Ki67的表达水平明显低于生理盐水组(P<0.01)。

十全大补汤调节血管生成促进因子和抑制因子的平衡:①十全大补汤对小鼠血清中VEGF表达水平的影响:当对小鼠模型进行为期10d的治疗后,检测两组小鼠中的VEGF浓度,结果显示在经过十全大补汤治疗的小鼠中,与原发瘤切除组相比,其浓度有着显著的降低,两组之间的差异有统计学意义(P<0.01)。②十全大补汤对小鼠血清AS表达水平的影响:当对小鼠模型进行为期10d的治疗后,检测两组小鼠中的AS表达水平,结果显示在经过十全大补汤治疗的小鼠中,与原发瘤切除组相比,其浓度有着显著的升高,两组之间的差如刷牙、洗脸等。

张晓婕则使用3个步骤,优点是在活动上更加细化,但是在第1步骤时间跨度比较大,患者难以接受,需要理疗师帮助才能完成,因此往往造成患者的依赖心理。具体时间划分为术后1d~6周进行肩关节活动,术后7~12周进行肩关节主动活动,术后12周后进行抗阻训练。

综上所述,肱骨外科颈骨折术后肩关节功能康复护理是不断发展的,旨在越来越系统、完善地帮助患者术后患肢的功能恢复,生活质量的提高。

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