摘要：枇杷同其他木本果树一样，遗传上是高度杂合的，因此，获得真杂种是进行杂交育种等遗传改良的重要基础工作。以我国的特早熟优质枇杷品种早钟6号作母本，分别以西班牙的3个大果型品种作父本进行种内杂交；并以栎叶枇杷为母本与普通枇杷的解放钟作父本进行远缘杂交，4个杂交组合(ZJ、ZU、zP和Li)共获得493株杂种苗。运用RAPD分子标记，对这些杂交苗进行早期杂种鉴定，根据有无父本的特征带或新带型来鉴定其是否杂交成功，4个组合从100条RAPD引物中共计筛选出9条具有父本特征带的引物，鉴定454株杂种苗为真杂种。试验获得的真杂种苗可为枇杷品种的选育提供重要资源。
关键词：枇杷：RAPD；杂种鉴定
中图分类号：S667.3
文献标识码：A
文章编号：1009-9980f2010103-385-06
许多果树在杂交选育新品种时常常因品种间串粉、去雄或套袋不及时等因素，造成真假杂种苗混杂。在实际工作中可以利用形态学、细胞学以及分子标记等方法进行杂种苗的鉴定。每种方法各有其优缺点。形态学标记的主要缺点是易受环境条件和发育状态的影响：细胞学鉴定杂种工作量大，也比较烦琐；分子标记技术的发展，为我们提供了从DNA水平即基因水平上来检测种子纯度的有利工具，最终通过电泳图谱检测差异性，其多态性强，准确性高。RAPD标记为显性，对杂种的鉴定可以根据有无父本的特征带或在杂交后代中出现双亲所不具有的条带(即新带型)鉴定其是否杂交成功I引。根据孟德尔遗传规律，理论上每个标记只能鉴定出50％的杂种，这样标记Ⅰ(50％)十标记Ⅱ(25％)+标记Ⅲ(12.5％)+标记Ⅳ(6.25％)=93.75％，4个标记便可将F1代群体中93.75％的杂种鉴定出来。由于RAPD的显性遗传特点，在用双亲进行引物筛选时无法判断父本特征位点是否为纯合位点，有可能出现母本的显性位点，故分析时必须结合多个RAPD标记(不少于3个)进行分析。新带型是在杂交后代中出现而在双亲中均没有的条带，在真假杂种鉴定时我们直接判断其为真杂种。
宋爱云等利用RAPD技术对香樟6个优选株和2个普通株的遗传多样性进行了分析，确定了它们的遗传关系。刘静等综述了分子标记技术在石斛属植物中的应用研究，认为RAPD是研究石斛属植物的遗传多样性真伪的有效方法。Graham等在分析英、美、荷兰等国家不同育种草莓组培苗时提出：亲本的选配要选择遗传距离较大的材料，才有利于体现杂交优势。RAPD标记被认为是进行枇杷杂种鉴定的一种简单、快速有效的方法。
枇杷属于蔷薇科(Rosaceae)枇杷属(Eriobotrya)，种质资源丰富，原产我国的枇杷属植物有21个种(包括5个变种或变型)，栽培品种的枇杷为普通枇杷(E.japonica Lindl.)，经过长期栽培驯化及选育，形成了许多各具特色的品种。世界上几个主要的枇杷生产规模较大或科研较先进的国家，在品种资源上形成了各自的特色。中国的枇杷品种资源最丰富，有黄肉品种200多个和白肉品种100多个；日本主要是黄肉枇杷品种，不足100个品种，然而杂交育成的品种占有较大比例，品质较好：西班牙也主要是黄肉品种，也不足100个，但西班牙有若干个果实较大的品种，其中3个品种的平均单果质量都超过90g，其大果性在国际枇杷上独占鳌头。
我们选用我国特早熟优质的早钟6号枇杷和3个大果型西班牙品种杂交，以及用栎叶枇杷和普通枇杷中的解放钟进行远缘杂交，共获得4个杂交组合(ZJ、ZU、ZP和Lj)，共计有493株杂种苗，采用RAPD标记对这些杂种苗进行早期鉴定。研究在聚合不同国家枇杷品种的优良特性方面，在远缘杂交创造新种质方面：以及在利用分子标记早期鉴定杂种以期提高枇杷杂交育种的效率等方面，都具有重要意义。
1 材料和方法
1.1 材料
2004年12月份进行了普通枇杷种内的3个组合的杂交和栎叶枇杷×普通枇杷1个组合的杂交，杂交按常规方法进行。次春收获种子播种获得杂种苗。杂交的3个群体即早钟6号×西班牙品种Javierin(ZJ)杂种苗共计202株、早钟6号xUllera(ZU)杂种苗共计94株、早钟6号xPeHuches(ZP)杂种苗共计83株、栎叶枇杷×解放钟(Li)杂种苗共计114株。
1.2 方法
1.2.1 杂交实验 杂交选取枇杷盛花期含苞待放的花蕾，每穗留花10-15朵，去除雄蕊，将收集的父本的花粉点在母本的柱头上，授粉后用双层纸袋隔离，待幼果成型去掉外面一层，里面一层保留至果实成熟。
1.2.2 枇杷基因组DNA的提取枇杷基因组DNA的提取参照刘月学等…J和乔燕春等的方法。
1.2.3 RAPD体系和扩增程序参照杨向晖和吴锦程等㈣的方法，25μL的反应体系中，Mg2+为2.0mmol·L-1，酶为1.0U，引物为0.2μmol·L-1，dNTPS为0.10mmol·L-1；扩增程序为：94℃5min(预变性)；94℃40s(变性)→38℃1 min(复性)→72℃1min(延伸)(45个循环)；72℃10min(后延伸)。
2 结果9分析
2.1 RAPD引物筛选
实验随机选取100条能在枇杷上扩增产生多态性的RAPD引物，进一步对早钟6号、Javierin、Pel-luches、Ullera、栎叶枇杷和解放钟6个亲本的基因组DNA进行扩增，经3次重复，筛选出能在Javierin、Pelluches、Ullera和解放钟4个父本中稳定扩增的特征带共计9条引物，引物序列见表1。
2.2 4个组合RAPD扩增图样
2.2.1 早钟6号~Javierin F，代群体鉴定 从100条RAPD引物中筛选出具有父本Javienn特征带的引物，分别为G16、AB04、AVl9、BC20和BE02，进一步对202株早钟6号和Javiefin的杂交后代进行扩增，最后有28株杂交苗无法确定是否为真杂种：其余的鉴定为真杂种，真杂种率为86.2％。图1和图2分别是引物G16和AB04的部分扩增结果。经重复实验，获得的结果稳定可靠，可以作为鉴定真杂种的依据。
2.2.2 早钟6号×Ullera F1代群体鉴定
从100条RAPD引物中筛选出具有父本Ullera特征带的引物AC06、G16、AB04、AVl9、BC20对94株早钟6号和Ullera的杂交后代进行了扩增，最后有9株杂交苗无6号和Pelluches的杂交后代进行扩增，编号为6的杂交苗无法确定是否为真杂种：在扩增的谱带中还发现双亲都没有，而在后代66号和68号中出现的
新带型，在杂种鉴定中，新带型的出现更能直观反映真杂种的鉴定情况，但这类带型出现的几率较小，不能作为真杂种鉴定的主要研究手段。结合父本特征带和新带型的结果，真杂种率为98.8％。图4是AC06的鉴定情况。经重复实验，结果可靠。
2.2.4 栎叶×解放钟F1代群体鉴定 栎叶枇杷和解放钟杂交组合为种间杂交，亲本之间差异较大，筛选父本解放钟的特征带较为容易，本研究仅筛选20条引物，获得具父本特征带的引物F05、F06，且这2个引物扩增获得的父本特征带均为纯合显性位点即AA型，AA型的位点是进行杂种鉴定最为理想的位点，这类型位点在亲缘关系较远的亲本间出现频率较高，图5为引物F05对114株Lj组合杂交后代的鉴定情况，图中可以看出，引物F05在父本解放钟中有多个位点为纯合显性位点，经重复试验，结果稳定可靠，进一步利用引物F06进行扩增，获得的鉴定结果较为一致。114株杂交苗均为真杂种，真杂种率为100％。
3 讨论
常规杂种鉴定有形态学鉴定和细胞学鉴定等方法，陈志坚等利用锤度具有高度可遗传的品质特性，对22个甘蔗家系F1群体材料进行了杂种鉴定。然而木本果树童期长，杂种后代幼苗在形态上很难区分；利用细胞学鉴定，杂交后代的染色体数目相同不能直接识别，通过基因组原位杂交技术可以进一步解决，陈春丽等利用基因组原位杂交技术对属间杂种枳橙进行了有效的鉴定。尽管原位杂交技术获得的实验结果较为直观，但耗时较长，花费较高，不适于大量材料的杂种鉴定。由于RAPD分子标记具有遗传稳定，不受环境变化、发育阶段和组织器官的影响，具有较高的稳定性、而且操作简便，近年来RAPD分子标记技术广泛应用在许多作物的杂种鉴定中，栾雨时等利用RAPD分子标记鉴定了番茄杂种的纯度，获得的结果可快速的应在番茄育种中。本试验利用RAPD技术对3组种内杂种和l组种问杂种的杂交苗进行了早期鉴定，检测的方法主要是父本遗传信息渗入到后代中，或存后代中出现新带型(杂交后代中有而双亲无的带型)，我们就可断定此F，代单株为杂种实生苗。南于RAPD的显性遗传特点，在用双亲进行引物筛选时无法判断父本特征位点是否为纯合位点，故分析时必须结合多个RAPD标记(一般为3～5个)进行综合分析。父本特征带的基因型为AA或者Aa时，特征带在后代中出现分离则可判断其为Aa，不出现分离则为AA。用AA型的父本特征带进行真假杂种鉴定，可以达到只用一个引物就可以鉴定出所有真假杂种的效果，如栎叶和解放钟杂交群体用引物F05就可以将114株杂种鉴定出来。而在杂交后代中出现新带型的机率并不高，因此鉴定杂种是否为真杂种主要以出现父本的特征带为主，一旦出现杂交后代有而双亲无的特征带，我们直接判断其为真杂种。
本研究结果对于枇杷遗传改良具有多方面的意义。首先，利用RAPD分子标记技术可以对枇杷种内杂交和种间杂交进行早期快速鉴定和识别，是枇杷杂交育种的有效辅助手段；第二，枇杷树体较大，种植杂种苗需要很多的土地。利用有限的土地种植真正的杂种苗，既提高效率又节约土地；第三，鉴别出真正的杂种苗，可以为创建枇杷分子遗传图谱的作图群体，提供可靠的基础。关于创建枇杷分子遗传图谱的结果另文报道。
4 结论
利用RAPD分子标记技术，对4个杂交组合(ZJ、ZU、ZP和Li)获得的493株杂种苗进行了早期杂种鉴定。从100条RAPD引物中共计筛选出9条具有父本特征带的引物，鉴定出真杂种苗454株。本研究利用西班牙的大果型枇杷和我国选育的优质早熟的早钟6号枇杷杂交，以期获得适合我国栽培的优质早熟的大果型枇杷品种：利用野生栎叶枇杷和解放钟枇杷杂交，使野生资源中的优异基因源向栽培品种转化，进而获得抗逆性强的栽培品种。本试验获得的真杂种苗为进一步枇杷品种的选育提供重要资源。