[摘要]贝壳杉烯酸氧化酶（kaurenoic acid oxidase）是二萜赤霉素生物合成途径上的关键酶，参与植物生长发育等重要生物学过程。该文根据雷公藤转录组数据设计特异性引物，采用PCR技术克隆得到贝壳杉烯酸氧化酶全长cDNA序列，并进行生物信息学分析；使用实时定量PCR（qRTPCR）研究基因的诱导表达水平。克隆得到TwKAO长度为1 874 bp，编码487个氨基酸，蛋白相对分子质量5602 kDa，理论等电点889；经茉莉酸甲酯（MeJA）诱导后，TwKAO基因相对表达量在12 h达到峰值；经植株组织表达分析证实，TwKAO基因在雷公藤的叶中表达量最高，根中最低。该研究首次克隆得到雷公藤KAO基因，并分析其mRNA表达特征，为深入研究雷公藤生长发育以及萜类活性成分次生代谢研究奠定基础。
[关键词]雷公藤； 贝壳杉烯酸氧化酶（KAO）； 克隆； 生物信息学分析； 表达分析
药用植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook f系卫矛科木质藤本植物，临床中多使用其根或根的木质部入药，具有抗炎、神经保护、免疫调节、抗肿瘤等活性，可用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等免疫疾病。近年来发现，雷公藤中重要的二萜类成分雷公藤甲素在抗肿瘤尤其是治疗胰腺癌[12]方面具有显著疗效。由于其广泛的药理活性，对雷公藤有效成分药理作用、生物合成等方面的研究得到越来越多的关注[35]。
赤霉素是植物生长发育中必不可少的激素，参与植物生长包括种子萌发，茎伸长以及开花等过程。而赤霉素的生物合成过程中，从ent贝壳杉烯、ent贝壳杉醇、ent贝壳杉醛到ent贝壳杉酸，再到ent7过羟基贝壳杉烯酸等连续反应都是由 CYP450催化而成[6]。贝壳杉烯酸氧化酶（kaurenoic acid oxidase，KAO）参与从贝壳杉烯酸到GA12的反应过程[7]，其属于细胞色素P450中CYP88A亚家族，参与赤霉素生物合成途径中3步连续的催化反应[8]。目前，KAO基因已从小麦[910]，豌豆[11]，梨[12]等植物中克隆得到，并研究其缺失对向日葵矮小突变体的影响[13]。
雷公藤中KAO基因尚未克隆得到，因此本研究以雷公藤悬浮细胞为研究材料，克隆得到长度为1 874 bp的TwKAO基因，研究其在茉莉酸甲酯（MeJA）诱导后240 h内基因的表达水平，并进行生物信息学分析，为进一步研究雷公藤重要活性成分生物合成提供宝贵的基因资源。
1材料
11植物雷公藤悬浮细胞由首都医科大学中药资源与分子生药学实验室继代保存。培养条件：05 mg·L-1 2，4D + 01 mg·L-1 KT+05 mg·L-1 IBA+MS液体培养基，25 ℃，120 r·min-1避光培养。
12菌株及载体Escherichia coli Trans 5α感受态细胞、pEASYT3 vector购自北京全式金生物技术有限公司。
13仪器与试剂VeritiTM 96孔梯度PCR仪，TF 7500 型Real Time PCR System为美国 Applied Biosystems 公司，318k型高速冷冻离心机为SIGMA公司；PhusionHighFidelity PCR Master Mix with HF Buffer購自美国NEB公司；Fast Quant RT Kit （With gDNase）、琼脂糖凝胶回收试剂盒、RNA纯化试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，EastepSuper总RNA提取试剂盒购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司，其他试剂为国产分析纯。引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，测序服务由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。
2方法
21RNA提取与纯化使用CTAB法提取雷公藤悬浮细胞总RNA并依据RNA纯化试剂盒说明书进行纯化，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。
22全长cDNA克隆与测序使用Fast Quant RT Kit将雷公藤悬浮细胞总RNA反转录成cDNA，根据雷公藤悬浮细胞转录组数据设计全长特异性引物
24TwKAO基因的诱导表达分析于雷公藤悬浮细胞继代培养12 d后，使用茉莉酸甲酯（50 μmol·L-1）诱导，设置对照组。于诱导后不同时间点（0，12，24，48，72，240 h）取样，每个时间点设置4个平行样品。使用EFLα基因作为内参基因，根据所得TwKAO序列设计实时荧光定量特异性引物。提取雷公藤悬浮细胞总RNA并反转录成cDNA，进行TwKAO基因的诱导表达分析。实时荧光定量反应体系：10 μL 2×SYBR green Mix，04 μL ROXHigh、正反引物（10 μmol·L-1）各 04 μL，78 μL ddH2O和1 μL cDNA 。反应程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40个循环。每个反应重复 3次，用 2-ΔΔCt法分析其mRNA相对表达水平。
25TwKAO基因的组织表达分析使用EastepSuper总RNA提取试剂盒，分别提取3株生长年限相近的雷公藤植株根、茎、叶RNA并反转录成cDNA。使用EFLα基因作为内参基因，进行TwKAO基因的组织表达分析。方法同诱导表达分析方法。
3结果与分析
31TwKAO基因全长cDNA获得对雷公藤转录组设计的特异性引物进行全长PCR，克隆获得长度为1 874 bp的TwKAO全长序列，见图1。
32TwKAO基因序列分析TwKAO全长序列长度为1 874 bp，在152～1 615 bp位置具有完整的开放阅读框（ORF），推测编码487个氨基酸，序列的1～151 bp为5′UTR，1 616～1 874 bp为3′UTR。BLAST结果显示，其与板栗Castanea mollissima相似度76%，与可可树Theobroma cacao相似度76%，与川桑Morus notabilis相似度74%，与苹果Malus domestica相似度74%，与西洋梨Pyrus communis相似度73%。使用DNAMAN软件将TwKAO与板栗（AEF32085），川桑（XP_0100977241），苹果（AGI656301），西洋梨（AGF252661），木豆（KYP520511），毛国杨（XP_0023194471）KAO氨基酸序列进行多重序列比对，结果表明相似度高达8220%。结合Interpro Scan结构域分析，TwKAO存在高度保守区Cytochrome P450 cysteine hemeiron ligand signature（427～436 aa位）：[FW][SGNH]x{F}[RKHPT]{P}C[LIVMFAP][GAD]，见图2，亚铁血红素活性位点见图中标注。
33TwKAO氨基酸序列的系統进化分析将TwKAO与GenBank下载的其他物种 KAO氨基酸序列进行比对分析，利用 MEGA 60软件采用相邻连接法构建系统进化树，见图3。选取15种植物（包括13种双子叶植物，1种单子叶植物，1种蕨类植物）和2种真菌的KAO氨基酸序列，从进化树中可以看出：双子叶植物、单子叶植物、蕨类植物、真菌聚成单独的分支，其中TwKAO归为双子叶植物分支。
34TwKAO理化性质及3D结构预测使用ExPASy在线软件ProtParamtool预测TwKAO蛋白得到其相对分子质量5602 kDa，理论等电点889；带负电荷的残基（Asp+Glu）52，带正电荷的残基（Arg+Lys）60；不稳定系数3892，蛋白分类属于稳定蛋白；脂肪系数8969，该蛋白为亲水性蛋白。信号肽预测表明TwKAO为非分泌蛋白，不具有信号肽；亚细胞定位分析显示其可能位于内质网；同时跨膜域分析显示，TwKAO位于膜外，为非膜蛋白。三维同源模型见图4，以2ve31A蛋白为模板，用于建立模型的氨基酸残基为36～482位，序列同源性2827%。
35TwKAO基因的诱导表达分析实时荧光定量PCR实验检测了MeJA处理后不同时期雷公藤悬浮细胞中TwKAOmRNA表达情况，采用2-ΔΔCt方法进行相对定量表达分析，见图5。结果显示，雷公藤悬浮细胞在受到MeJA刺激后12 h，TwKAO的相对表达量达到峰值，为同时期对照组的242倍，后相对表达量迅速降低回复至正常水平。
36TwKAO基因的组织表达分析实时荧光定量PCR实验检测了3株生长年限相近的雷公藤植株不同组织部位（根、茎、叶）TwKAO基因表达情况，见图6。TwKAO基因的表达量在根、茎、叶中依次升高。叶中表达量最高，是茎表达量的149倍，是根中表达量的396倍。
4讨论
植物赤霉素作为重要调节激素参与植物的生长发育，而赤霉素缺乏易引起植物发育不良，出现异于正常生长的矮小突变株。因此，对植物赤霉素生物合成途径的解析及其关键酶的挖掘显得尤为重要。本研究首次从雷公藤悬浮细胞中克隆得到雷公藤贝壳杉烯酸氧化酶基因，经过结构域分析显示其含有细胞色素P450的亚铁血红素活性位点，同时与其他已知物种KAO氨基酸序列相似度较高，因此命名为TwKAO。
KAO基因在不同品种及不同组织部位表达水平各不相同，在种子、叶等赤霉素合成较为旺盛的组织中表达量较高[12]。MeJA作为一种常用的诱导子，对种子萌发，根生长，果实成熟及衰老均有调节作用[14]。另外，茉莉酸类成分促使植物防御反应以应对虫害、各种病原体及环境胁迫，如干旱、低温和盐胁迫等。Sophie等[15]通过MeJA处理拟南芥叶和根，发现氢过氧化物含量提高，表明体内出现氧化应激反应。他们选择拟南芥氧化还原反应蛋白作为研究对象，通过对比荧光标记和蛋白胶，确定大量氧化还原应答，MeJA处理后蛋白大量变化以应对，同时，压力和防御蛋白也大量表达。此外，那些参与茉莉酸生物合成、次生代谢反应、细胞壁合成、编码压力保护和防御的基因都可被MeJA诱导表达上调[16]。本研究选择雷公藤悬浮细胞继代后12 d作为诱导初始时间，排除了细胞生长及逆境等因素造成植物基因表达的干扰，细胞生长稳定，对照组可见基因相对表达量逐渐降低。经过MeJA诱导后，TwKAO相对表达量仅在12 h达到峰值，为同时期对照组的242倍，后迅速下降至正常水平，符合MeJA对于植物诱导引发的应激反应规律。后期可以进一步分析赤霉素作为促进植物生长的激素与同样对萜类次生代谢具有调节作用的MeJA二者生物合成途径的关联性。本研究成功克隆获得雷公藤贝壳杉烯酸氧化酶基因，为深入研究雷公藤生长发育以及萜类活性成分次生代谢提供宝贵的基因资源。
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