^ؚ(brGt(kf
ڦ jw^Ƭ*^rkiXBxՑf-Eь}Y F)V ї#}GU 2
6i{Ğ"{)ybvu w{}4(b)Z֧tZ(t-z{^ "bjx,I!1'*'jwPڞاxyjx
M5
ki--k*'nyڗ+bqfzhu+z)ڶ*'_vjwu_vשק&rj^h[X'\&j a֧uj,-ē^ rם+a~Ɯ֜z'uUݶrןj^wx^ũjw\y۩o)b蝖*ZحӅj\z ڵh%i)jjW rb
ajz%jwpjrj)
5W_q"w
v'n*'N ݩڗ+^ߢu-)xjبD,&zw^^"+ޚ^ȧk*ezrبj'+x DƧv؟[mzږZ֫vgS&jب˫, v
(vXy$zX u^rبjwehj{bbrC{NZݴ )ybrazbezӝt䂷+jx u蛭|<jدzZ֫uׯb{H9^aj}u8bgb'z{Z.֛^u^hjبzȝ(~˥~ښ'^ݶק&r
+vbr虫h+Zצ,&z,#rW蝩u)ק&4^]-t:r]4vm5O4_]kj'nzX/nt M4 M H7z]v}xMoV"https://www.newsipay.com/t/cailiao/" target="_blank" class="keylink">材料与方法
1.1 材料与试剂
鸡肉样品为市购。
23种药物标准品：磺胺胍（sulfaguanidine，SG）、磺胺二甲基异嘧啶（sulfisomidine，SMD）、磺胺醋酰（sulfacetamide，SA）、磺胺嘧啶（sulfadiazine，SD）、磺胺噻唑（sulfathazole，ST）、磺胺吡啶（sulfapyridine，SPD）、磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine，SMR）、磺胺二甲基噁唑（sulfamoxol，SM）、磺胺二甲基嘧啶（sulfadimidine，SDMD）、磺胺对甲氧嘧啶（sulfameter，SMT）、磺胺甲噻二唑（sulfamethizole，STZ）、磺胺甲氧哒嗪（sulfamethoxypyridazine，SMPD）、磺胺间甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine，SMM）、磺胺氯哒嗪（sulfachlorpyridazine，SCP）、磺胺邻二甲氧嘧啶（sulfadimoxine，SDX）、磺胺甲基异噁唑（sulfamethoxazole，SMZ）、磺胺氯吡嗪（sulfaclozine，SCZ）、磺胺二甲异噁唑（sulfisoxazole，SIZ）、磺胺苯酰（sulfabenzamide，SBZ）、磺胺间二甲氧嘧啶（sulfadimethoxine，SDM）、磺胺喹噁啉（sulfaquinoxaline，SQX）、磺胺苯吡唑（sulfaphenazolum，SP）、甲氧苄氨嘧啶（trimethoprim，TMP），纯度均在98% 以上 德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈、正己烷、甲酸均为色谱纯；水为超纯水；无水硫酸钠为分析纯。
1.2 仪器与设备
TSQ Quantum Ultra EMR串联质谱仪（配有电喷雾离子（ESI）源）、Surveyor液相色谱系统（包括Autosampler 1.3自动进样器）、MS Pump 2.0质谱泵 美国ThermoFisher公司；C18柱（150mm×3.1mm，3.5 µm） 美国Agilent公司；C18固相萃取小柱（3mL/500mg） 美国Supelco公司；氮吹仪美国Organomation公司；超纯水器 美国Millipore公司；离心机 美国Sigma公司；超声波清洗仪宁波新芝生物科技公司；Oasis HLB固相萃取小柱（3 mL/60mg）、Oasis MCX固相萃取小柱（3 mL/60mg） 美国Waters公司。
1.3 方法
1.3.1 标准储备液的配制
分别精密称取上述23种标准品适量，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L标准储备液，于冰箱中冷冻避光保存。
1.3.2 混合标准溶液的配制
分别准确吸取上述储备液各适量，置同一容量瓶中，用甲醇稀释制成含有上述23种物质各1.0 mg/L的混和标准溶液。
1.3.3 样品提取
准确称取（5.00±0.05）g样品于50 mL 离心管中，加入10 mL甲酸-乙腈（1：199，V/V）溶液，于涡旋混合器上混匀1 min，超声波提取10 min；加10 g无水硫酸钠，以8000 r/min的速率离心3 min，转移上层有机溶液至20 mL氮吹管中；再用10 mL甲酸-乙腈（1∶199，V/V）溶液重复提取残渣1次，合并2 次提取液于氮吹管中，于45 ℃水浴中氮吹至干，用1.0 mL甲醇-水（2∶8，V/V）溶解，加入1.0 mL正己烷溶液，涡旋混匀，于4 ℃、10000 r/min离心3 min，下层溶液经0.22 μm滤膜过滤至进样瓶中，供液相色谱-串联质谱仪分析。
1.3.4 仪器参数及测定条件
1.3.4.1 色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 µm）；进样量：25 μL；柱温：30 ℃；流动相：A为体积分数为0.1%甲酸-水溶液，B为甲醇；梯度洗脱条件：0～2 min，流动相A为90%；2.5～4.5 min，流动相A为30%；6.3～10.5 min，流动相A为70%；11～14 min，流动相A为10%；流速：250 μL/min。
1.3.4.2 质谱条件
采用电喷雾电离源（electrospray ionization，ESI）源；正离子方式扫描；喷雾电压：3000 V；离子源温度：400℃；鞘气：45bar，辅助气：10 bar；毛细管温度：350 ℃；多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）方式检测；优化质谱条件见表1。
2结果与分析
2.1 提取溶解的选择
本实验在查阅大量参考文献[15-17，22]的基础上比较了乙腈、甲酸-乙腈（1∶199，V/V）、甲酸-乙腈（1∶99，V/V）、甲酸-乙腈（2∶98，V/V）和乙酸乙酯的提取效率。结果表明：上述几种溶剂对磺胺类药物及其增效剂均有较好的效果，使用乙酸乙酯提取时，会提取出较多的脂肪，后续的脱脂净化较难，影响色谱柱的使用寿命；乙腈和酸性乙腈都具有沉淀蛋白的效果，提取出的脂肪含量较低，有利于后续脱脂净化，由于磺胺类药物具有弱碱性，易溶于酸性溶液，采用甲酸-乙腈混合溶剂提取效率高于乙腈，同时实验对甲酸的用量进行优化，当随着甲酸浓度增加，大部分磺胺的回收率下降，因此采用甲酸-乙腈（1∶199，V/V）混合溶液作为提取溶剂。
2.2净化方法的比较
鸡肉样品中蛋白质和脂肪含量较高，提取过程中需要去除蛋白质、脂肪干扰物质，实验研究了液-液分配萃取净化结合冷冻高速离心脱脂除蛋白和固相萃取净化后的效果，同时结合磺胺类药物具有弱碱性的化学性质。本实验选取理论上适合其净化的C18、HLB和MCX小柱进行比较，结果表明：液-液分配萃取净化结合冷冻高速离心处理的方法回收率最高，HLB小柱净化效果优于C18和MCX小柱。样品经正己烷脱脂，高速冷冻离心后大部分脂肪和蛋白质被除去，固相萃取小柱对目标物可以净化和富集，但在操作过程中目标物会损失导致回收率降低，从实验周期、经济和环保方面考虑选取正己烷脱脂液-液分配净化。
2.3质谱条件的优化
磺胺类药物为弱碱性，结构式中具有仲氨基或叔氨基的化学电离性质，理论上选用ESI+作为离子化模式，在ESI+离子模式下容易得到H+形成较为稳定的[M+H]+准分子离子峰。实验采用注射泵直接进样的方式，将质量浓度为1μg/mL的每种标准物质，以5μL/min的流速分别注入离子源中在正离子模式下对每种物质进行一级质谱分析，得到每种分子离子峰，再对每种物质的准分子离子峰进行二级质谱分析，得到其相应的碎片离子信息，然后对每种物质的二级质谱进行碰撞能量、碰撞气、辅助气、喷雾电压、透镜补偿电压等参数优化，使每种物质的分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大时为最佳。
2.4 色谱条件的优化
实验同时测定的物质有23种，磺胺类药物存在多组同分异构体，特别是磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺甲氧哒嗪，3种物质性质极为相似很难将其分离。实验中比较了Thermo Hypersil GOLD柱（150 mm×2.1 mm，5 µm），Thermo Hypersil GOLD柱（100 mm×2.1 mm，3 µm），Agilent ZORBAX SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 µm）和Agilent Polaris 5 C18-A柱（100 mm×2.0 mm，5 µm）对正离子模式下23种物质的分离效果、响应强度和峰型。结果表明：23种物质在Agilent ZORBAX SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 µm）上有最理想的分离效果、响应强度和峰型。磺胺类药物结构中含有氨基，水溶液中呈弱碱性，色谱峰易出现拖尾现象，当在流动相中加入一定量的甲酸，在酸性条件下促进磺胺类物质的电离，提高了离子化效率；同时甲酸有助于色谱柱内硅醇基的质子化，消除硅醇基与目标物之间的相互作用，减少色谱峰的拖尾，提高了分离效果。实验比较了在流动相中添加体积分数为0.02%、0.05%、0.1%、0.2%和0.5%甲酸对目标物的响应和峰型的影响，结果表明：选用0.1%甲酸水溶液和甲醇作为流动相获得了最好的分离效果、响应强度和峰型。磺胺类化合物极性差异大和存在同分异构体现象，采用等度洗脱不容易将多组分磺胺分离，需要采用梯度洗脱进行分离。在梯度洗脱的开始阶段以10%甲醇作为流动相将极性较强的组分先洗脱出来，3 min后逐渐增加甲醇的比例，提高了同分异构体的分离度，使极性弱的组分逐一分离，实现了23种物质的有效分离。
2.5线性范围、检出限和定量限
为消除基质效应按照1.3.3节处理步骤提取阴性鸡肉样品，配制6个不同质量浓度的标准溶液，溶液中磺胺类及其增效剂质量浓度为2、5、10、20、50、100ng/mL；在本法所确定的色谱和质谱条件下进样测定，以标准溶液质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，23种化合物的线性方程、相关系数如表1所示。
在空白鸡肉中添加混合标准品，以信噪比（S/N）≥3，确定方法的检出限为0.5 μg/kg；以信噪比≥10确定方法的定量限为2.0 μg/kg；鸡肉样品中添加2.0 μg/kg 23种混合标准物质的MRM色谱图见图1。
2.6方法的回收率和精密度
选取阴性鸡肉样品，添加23种磺胺及增效剂混合标准品，添加水平为2.0、5.0、10.0 μg/kg，每个添加5次平行，按上述优化的实验方法测定个组分的回收率和相对标准偏差，结果如表5所示。
3 结 论
实验建立了鸡肉中22种磺胺及其增效剂残留量同时测定的高效液相色谱-串联质谱法。样品经过甲酸-乙腈（1：199，V/V）溶液提取，正己烷脱脂，液-液分配净化，无需固相萃取净化，高效液相色谱-串联质谱测定。方法的定量限为2.0 μg/kg，空白鸡肉添加回收率为61.8%～88.3%，本方法检测周期短，灵敏度较高，回收率较好，满足实际检测工作的需要，适用于鸡肉中22种磺胺及其增效剂残留量的定性定量分析及确证。
参考文献：
[1]DIAZ T G， CABANILLAS A G， SALINAS F . Rapid determination of sulfathiazole， oxytetracycline and tetracycline in honey by high-performance liquid chromatography[J].Analytical Letters， 1990， 23（4）：607-616.
[2]李俊锁， 邱月明， 王超.兽药残留分析[M]. 上海： 上海科学技术出版社， 2002：228-229.
[3]SHAO Bing， DONG Dan， WU Yongning， et al. Simultaneous determination of 17 sulfonamide residues in porcine meat， kidney and liver by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Analytica Chimica Acta， 2005， 546（2）：174-181.
[4]王重洋， 王远鹏， 王宁， 等.基质固相分散-超快速液相色谱法测定牛肉中磺胺类兽药[J].分析化学， 2013， 41（1）：83-87.
[5]何金华， 丘锦荣， 贺德春， 等.磺胺类药物的环境行为及其控制技术研究进展[J].广东农业科学， 2012（7）：225-229.
[6]黄冬梅， 黄宣运， 顾润润， 等.柱后衍生高效液相色谱法测定虾中14种磺胺类药物残留量[J].色谱， 2014， 32（8）：874-879.
[7]周明莹， 马健， 高湘萍， 等.高效液相色谱法检测海水中磺胺类药物残留[J].渔业科学进展， 2011， 32（2）：102-105.
[8]赵海香， 刘海萍， 闫早婴. 多壁碳纳米管固相萃取净化-高效液相色谱法测定猪肉和鸡肉中的磺胺多残留[J].色谱， 2014， 32（3）：294-298.
[9]GRANJA R H M M， de LIMA A C， SALERNO A G， et al.Validation of a liquid chromatography with ultraviolet detection methodology for the determination of sulfonamides in bovine milk according to 2002/657/EC[J].Food Control， 2012， 28（2）：304-308.
[10]洪蕾洁， 石璐， 张亚雷， 等.固相萃取-高效液相色谱法测定同时测定水体中的10种磺胺类抗生素[J].环境科学， 2012， 33（2）：652-657.
[11]张萍， 陈燕， 王晓玲.固相萃取-高效液相色谱法同时测定鸡蛋粉中12种磺胺类药物残留量[J].药物分析杂志， 2010， 30（12）：2338-2343.
[12]高进.毛细管气相色谱法测定蜂蜜中磺胺噻唑残留量[J].湖北大学学报（自然科学版）， 1997， 19（4）：393-394.
[13]赵晓凤， 杨中.气相色谱-串联质谱法检测猪肉组织中的磺胺二甲嘧啶残留量[J].饲料工业， 2007， 28（2）：54-56.
[14]蒋原， 沈崇钰， 姚义刚， 等.动物源性食品中磺胺类药物增效剂残留量的高效液相色谱-串联质谱法测定[J].分析测试学报， 2009， 28（7）：834-837.
[15]杜玥， 杨慧元， 徐伟东.液相色谱-串联质谱法测定猪肉中23种磺胺及其增效剂残留[J].药物分析杂志， 2010， 30（3）：471-478.
[16]刘佳佳， 佘永新， 刘洪斌， 等.高效液相色谱-串联质谱法同时测定动物源性食品中24种磺胺类药物残留[J].分析试验室， 2011， 30（2）：9-13.
[17]孙玉增， 徐英江， 刘慧慧， 等.液相色谱-串联质谱法测定海产品中21种磺胺类药物残留[J].食品科学， 2010， 31（2）：120-123.
[18]张岩， 马晓斐， 吕品， 等.液相色谱-串联质谱法同时测定牙膏中16种磺胺类药物残留[J].质谱学报， 2013， 34（4）：239-246.
[19]邵金良， 杨东顺， 王丽， 等.固相萃取-高效液相色谱法测定同时测定牛奶中13种磺胺残留[J].分析试验室， 2014， 33（11）：1322-1325.
[20]刘思思， 杜鹃， 陈景文， 等. 加速溶剂萃取-高效液相色谱-串联质谱联用测定莱州湾海水养殖区野生鱼肌肉中19种抗生素及2种磺胺代谢产物残留[J].色谱， 2014， 32（12）：1320-1325.
[21]中华人民共和国天津出入境检验检疫局， 天津科技大学， 中华人民共和国湖北出入境检验检疫局.SN/T 1960—2007进出口动物源性食品中磺胺类药物残留量的检测方法 酶联免疫吸附法[S].北京： 中国标准出版社， 2007.
[22]高洋洋， 张朝晖， 刘鑫， 等.超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中的磺胺增效剂[J].色谱， 2014， 32（5）：524-528.