摘要 [目的]为获得符合国家化学农药标准的粉红粘帚菌分生孢子可湿性粉剂。[方法]选择常用助剂和粉红粘帚菌分生孢子进行生物相容性检测，初步筛选出影响较小或者没有影响的助剂，筛选出的助剂，进行粉红粘帚菌可湿性粉剂的研制。[结果]最终确定10%可湿性粉剂的配方为：粉红粘帚菌的分生孢子粉10%，润湿分散剂EFW 1%、K12 2%、D425 7%、NNO 7%，紫外保护剂黄原胶0.3%，载体凹凸棒土补足100%。[结论]检测结果表明粉红粘帚菌分生孢子可湿性粉剂的润湿时间为18s，质量悬浮率75.87%，孢子悬浮率72.05%，pH 5.9，含水量1.92%，98.34% 可通过200目筛，符合国家化学农药可湿性粉剂的标准，为粉红粘帚菌可湿性粉剂的开发提供理论基础。
关键词 粉红粘帚菌；可湿性粉剂；研制
中图分类号 S718.85 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）05-01353-03
Abstract [Objective] The aim was to develop the qualified Clonostachys rosea WP which is in accordance with National Pesticide Standard. [Method] The pesticide adjuncts were screened according to biocompatibility. The wettable powder of Clonostachys rosea was developed with these screened adjuncts which have no or less effects on the bioactivities of Clonostachys rosea. [Result] The compositions of 10% Clonostachys rosea WP： Clonostachys rosea powder 10%； wettable and dispersible agents： EFW 1%， K12 2%， D425 7%， NNO 7%； UV protectant： Xanthan gum 0.3%； Palygouskite as filler make up to 100%. [Conclusion] The test results showed that the wettability was 18 second， weight suspensibility was 75.87%， spore suspensibility was 72.05%， pH value was 5.9， the moisture was 1.92% and the fineness was 98.34% through 200 μm sieve. Every index of wettable powder of Clonostachys rosea was in accordance with National Pesticide WP standard. This study may provide theoretical basis for the development of Clonostachys rosea wettable powder.
Key words Clonostachys rosea； Wettable powder； Preparation
粉红粘帚菌（Clonostachys rosea），隶属丝孢菌，是一类广泛存在于土壤中植物病原真菌的重寄生菌，大量研究表明，可以寄生多种植物病原真菌的菌丝和菌核，如核盘菌属（Sclerotinia）、腐霉菌（Pythium.spp）、立枯丝核菌（Rhizoctonia.solani）和齐整小核菌（Sclerotium rolfsii）等，还具有促进植物生长的作用[1-3]。粘帚菌作为菌寄生菌，其作用具有多机制特点，主要有产生抗菌素及毒素、重寄生作用、产生细胞壁降解酶以及协同作用等[4]。粘帚菌寄生病原菌的过程与哈茨木霉类似[5]，是粘帚菌生防作用的主要机理之一。目前，尚缺乏完善的方法对其作用方式进行全面的研究，深入研究粘帚霉的生防作用机制，有利于更好地控制植物真菌病害的的发生和充分发挥其生防潜质。粉红粘帚菌在国外应用较为广泛，在秘鲁，木霉菌和粉红粘帚菌混配成功防治可可荚腐病[6]，混合的生物控制剂不但实现更广泛的宿主范围，而且还提高了对环境的适应能力；Kapongo等以粉红粘帚菌分生孢子粉为载体稀释白僵菌孢子粉通过蜜蜂混合接种于温室套笼的番茄和甜椒上，可以控制温室白粉虱和牧草盲蝽，并成功抑制温室番茄和甜椒上的灰霉病，其中在番茄花和叶子上灰霉病的抑菌率分别为57%和46%，白粉虱死亡率达49%；在甜椒作物花和叶子上灰霉病的抑菌率分别为59%和47%，牧草盲蝽死亡率达73%[7]，在国内粉红粘帚菌代谢产物用于大豆根结线虫[8]，粉红粘帚霉作为一种生防制剂存在巨大的市场开发潜力。
鉴于粉红粘帚菌的产孢能力很强，且其孢子适于长期的保存和培养，对人类不造成危害，对生态系统无不良影响，同时兼顾粉红粘帚菌分生孢子的性质，可将其加工成固体制剂。由于分生孢子具有疏水性，影响其润湿性、分散性和悬浮性等物理性能，且作为活体农药，与各种助剂的相容性一般比化学农药差，某些助剂可能完全不能使用[9]。笔者以粉红粘帚菌分生孢子为原药，筛选出适合的载体、润湿剂、分散剂、紫外保护剂等助剂，加工成合格的可湿性粉剂，为工业化生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1
供试菌株。粉红粘帚菌（Clonostachys rosea），于国家林业局森林病虫害重点实验室（东北林业大学）保存。
1.1.2
助剂。供试载体：白炭黑、凹凸棒土、硅藻土、高岭土。供试润湿分散剂：Morwet EFW、k12、MF5、TERWET1010、WLNO、木质素磺酸钠、木质素磺酸钙、TERSPERSE 2020、Morwet D425、NNO。供试紫外保护剂：糊精、黄原胶、荧光素钠、VC 、纳米氧化锌。培养基：PDA；营养液：PD，以上助剂市售。
1.2 试验方法
1.2.1
助剂生物相容性的测定。采用平板计数法及菌丝生长生长量法。真菌孢子平板计数法：将载体以5 mg/ml（润湿剂60 μg /ml分散剂250 μg/ml）浓度与融化的PDA培养基混合[10]，灭菌后制成平板。取0.1 ml浓度为103个孢子/ml的孢子悬浮液均匀涂布在混合培养基平板上，以改良PDA作为对照，每个处理重复4个，放置在（25±1）℃黑暗培养，72 h后计算菌落数。菌丝生长速率测定：混合培养基制作方法同上，用直径为10 mm的打孔器取生长旺盛、菌龄相同的粉红粘帚菌菌丝块，接种在混合培养基的平板中心，对照是PDA平板，每个处理重复4次，每隔24 h测定一次菌落直径。
菌落直径日增长量（mm/d） =菌落直径（mm）/生长天数（d）
紫外保护剂：将供试保护剂添加到孢子悬浮液中，（以不加紫外保护剂但经紫外灯照射的为对照①，以不加紫外保护剂不经紫外灯照射的为对照②），涂布到PDA平板上，每个处理重复3次，在紫外灯下照射1、2、3 min后，放置于（28±1）℃的培养箱中，培养72 h计算菌落数。
1.2.2
助剂对制剂性能的影响。①首先对所测试润湿剂及分散剂进行初筛，选择润湿时间<1 min，悬浮状况优良的分散剂，然后进行生物相容性测定，其中润湿时间按照GB/T54512001标准执行[11]，通过目测观察分散状况，分散状况等级划分参考文献[12]：筛选出分散性能较好的分散剂，分别加入10%粉红粘帚菌孢子粉、5%润湿剂、10%分散剂和65%载体，加工成可湿性粉剂，测定润湿时间和悬浮率。②润湿剂和分散剂最优配比的筛选：对所选助剂种类和比例进行正交设计，确定两者的最佳使用比例[13]。
1.3 剂型的加工
经筛选出的各种助剂分别过400目标准筛，按比例加入到载体中搅拌均匀，然后将干燥过的粉红粘帚菌高孢粉加入到混合物中，混合均匀后加工成可湿性粉剂[14]。
1.4 产品性能测定
孢子萌发率测定[15]：将粉红粘帚菌孢子悬浮液接种到PD营养液中，于（28±1）℃和160 r/min转速下培养20 h后，显微镜检统计活孢子数，计算活孢子率。润湿时间按GB/T54512001测定（≤1 min）。悬浮率按GB/T148252006测定（≥75%）[16]。pH按GB/T160093测定[17]，细度通过激光粒径分布仪测定。
1.5 数据处理
试验数据采用SPSS16.0统计软件进行方差分析，评估不同处理之间的95%水平显著性差异。
2 结果与分析
2.1 载体的筛选
由表1可知，除硅藻土对粉红粘帚菌的分生孢子活性有影响外，其他载体与对照无显著性差异；从菌丝日增长量看，几种载体对菌丝的生长都有一定的影响，其中硅藻土与对照差异显著，其余3种载体与对照差异不显著，因此其余3种可作为粉红粘帚菌制剂的载体，从经济角度考虑，凹凸棒土作为粉红粘帚菌的可湿性粉剂的载体。
2.2 紫外保护剂的筛选
由表2可知，紫外照射对粉红粘帚菌分生孢子萌发有很大影响。在紫外照射1 min时，黄原胶与VC、纳米氧化锌对孢子保护作用明显，与对照②存在显著差异，糊精对孢子的保护作用不明显；紫外照射2 min后，黄原胶、糊精仍有保护作用，且与对照②存在显著差异，纳米氧化锌对孢子仍有保护作用，但与对照②差异不显著；紫外照射3 min后，黄原胶及纳米氧化锌对孢子的保护明显，且与对照②存在显著差异，糊精及VC对孢子也有保护作用，但是与对照②差异不显著，虽然黄原胶与对照①存在显著差异，但与其他及对照②仍存在显著差异，说明它能有效地保护孢子免受紫外损害。因此，可以选择黄原胶或纳米氧化锌作为紫外保护剂，鉴于成本考虑，故选择黄原胶。经进一步使用浓度筛选，最终确定浓度为0.3%。
2.3 润湿剂及分散剂的筛选
由表3可知，5種浓度60 μg/ml润湿剂对分生孢子的影响不同。从分生孢子萌发看，TERWET 1010、K12与对照差异显著，影响较大，其余几种润湿剂差异不显著；从菌丝日生长量看，只有EFW与对照差异不显著，其余几种润湿剂与对照差异显著。综合分生孢子萌发及菌丝直径日生长量，初选EFW、K12、WLNO进行润湿剂的下一步筛选。
初筛分散剂（浓度均为250 μg/ml）的生物相容性见表4。从分生孢子萌发角度看，木质素磺酸钠和TERSPERSE 2020与对照差异不显著，其余3个虽与对照差异显著，影响不大；从菌落直径日生长量看，TERSPERSE 2020与菌落生长影响较大，D425、木质素磺酸钠、木质素磺酸钙、NNO与对照差异不显著，且木质素磺酸钠促进菌丝生长，TERSPERSE 2020较对照差异显著，虽分生孢子为主要的侵染体，但综合制剂性能角度，这4种分散剂均可进行分散剂的细选。将上述粗筛的湿润分散剂以一定比例与孢子粉、载体加工成可湿性粉剂后，进行润湿时间和悬浮率的考察。不同润湿剂分散剂配制的可湿性粉剂的湿润时间和悬浮率见表5。
3 结论与讨论
通过对载体、润湿分散剂、紫外保护剂的筛选，确定了粉红粘帚菌可湿性粉剂的最佳配方为粉红粘帚菌的分生孢子粉10%，润湿分散剂EFW 1%、K12 2%、D425 7%、NNO 7%，紫外保护剂黄原胶0.3%，载体凹凸棒土补足100%，在此条件下制备的粉红粘帚菌可湿性粉剂分生孢子含量大于5×108个分生孢子/g。以粉红粘帚菌可湿性粉剂的润湿时间、质量悬浮率、孢子悬浮率和贮藏后的活孢率作为参考指标，既兼顾了制剂的性能，还参考了载体及助剂对粉红粘帚菌分生孢子的生物相容性，较全面地考虑到活体微生物剂型加工的要求。而目前粉红粘帚菌菌株制剂加工研究甚微，为我国粉红粘帚菌产品的发展提供了理论和技术基础，而其室外大田试验结果有待进一步研究。
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