菵草对3种ACCase抑制剂抗性的琼脂快速检测方法建立

对照。菵草幼苗接种：将培养至 2～3 叶期的菵草幼苗从土壤里挖出，操作时不要伤害根系，轻轻洗掉根系上的土壤，将洗净的幼苗放在吸水纸上，剪断过长的叶子。用镊子将根部插入培养基中。每个三角瓶接种10株幼苗，每处理重复3次。接种后用封口膜封住瓶口，在夜晚温度为 （16±1） ℃、白天温度为（21±1） ℃、12 h/d光照条件下培养。接种当天记为培养0 d，每隔24 h观察各处理新根生长情况至培养12 d，记录生长新根的株数，计算新根率。

新根率=生长新根株数/接种总株数×100%。

[BT1-*3][STHZ]2结果与分析

2.1菵草不同种群对3种除草剂抗性水平的整株测定

菵草种群对精唑禾草灵、高效氟吡甲禾灵和炔草酯的抗性水平整株测定结果见表3。结果显示，WC4#对3种除草剂的GR50分别为38.8、22.9、49.5 g a.i./hm2，均低于田间推荐剂量60、30和50 g a.i./hm2，此种群生长在荒地，无施药历史，为相对敏感种群。WC5#和WC8#对这3种药剂都产生了抗性，WC5#和WC8#对精唑禾草灵的抗性指数分别为60.8和75.1；对高效氟吡甲禾灵的抗性指数分别为18.5和12.3；对炔草酯的抗性指数分别为34.8和12.2。

2.2菵草对3种除草剂抗性的琼脂法检测

3个菵草种群在不含除草剂的琼脂培养基中的新根率随时间的变化情况见图1。WC4#、WC5#、WC8#的对照组从培养2 d开始就能够观察到新根发生，培养4 d新根率分别为26.67%、56.67%和667%，培养4～7 d新根率直线上升，培养7～11 d陆续达到最高，培养11 d新根率分别达到93.33%、100%和100%，培养12 d新根率不再增加，从地上部分已能观测到没有生长新根的植株死亡。

接种在含有0.05～0.20 μmol/L精唑禾草灵培养基的3个菵草种群，从培养2～3 d开始观察到新根发生，敏感种群WC4#在0.40、0.80 μmol/L浓度下随时间变化没有新根生长，抗性种群WC5#和

[FK（W11][TPZHM1.tif]

WC8#在0.40、0.80 μmol/L下最迟培养4 d可以观察到新根生长，培养5～11 d各浓度下菵草新根率持续增加，培养11 d菵草新根率达到最大值。3个菵草种群在含有高效氟吡甲禾灵和炔草酯的培养基中表现出与精唑禾草灵相似的规律。敏感种群在0.05～0.10 μmol/L高效氟吡甲禾灵培养基中，培养2～3 d开始有新根生长，0.20 μmol/L及以上浓度下没有新根生长，而抗性种群WC5#和WC8#在所有浓度下培养2～4 d均开始有新根生长。敏感种群在0.05～0.2 μmol/L 炔草酯培养基中培养2～3 d开始有新根生长，0.40、0.80 μmol/L浓度下没有新根生长，抗性种群WC5#和WC8#在所有浓度下培养2～4 d均开始有新根生长（表4）。

3结论与讨论

ACCase抑制剂类除草剂由于对禾谷类作物和双子叶作物田中的禾本科杂草均有较好的防效而被广泛使用[11]，但其作为抗性高风险级除草剂，单一连续使用后抗性发生较快[12]。刘宝祥等研究表明，连续施用精唑禾草灵9年后，菵草产生了抗性[13]。对田间杂草抗药性进行监测是及早发现和控制抗性发展的有效手段。目前常用的抗药性杂草的检测方法有以种子为检测对象的整株测定法和培养皿种子测定法、以花粉为检测对象的花粉萌发法、基于DNA的分子检测法等。整株测定法最常用于测定杂草对除草剂的抗性水平，能够较真实地模拟田间情况，反映杂草对除草剂的反应，但其检测周期长，占地大，不适应田间快速早期抗性的诊断。杨彩虹等采用培养皿种子测定法检测了日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵的抗性水平，与整株测定法相比具有较好的相关性，占地小，省力，但因以种子为试材，不能在生长当季进行检测[14]。Letouzé等运用花粉萌发法以花粉萌发率为指标，测定了大穗看麦娘（Alopecurus myosuroides）对精唑禾草灵、炔草酯、噻草酮的抗性水平，此法快速，但也有其局限性，如只能在开花季节进行检测，因而错过了最佳防除时机[9]。随着抗药性机制的深入研究，分子水平上的检测方法也很常见[15-17]，Délye等运用等位基因特异性PCR技术（allele-specific PCR，AS-PCR）检测了硬直黑麦草（Lolium rigidum）和大穗看麦娘对禾草灵、炔草酯和噻草酮的抗性突变[16]。Kaundun等运用衍生酶切扩增序列多态性技术（derived cleaved amplified polymorphic sequences，dCAPS）检测了黑麦草（Lolium perenne）、大穗看麦娘、野燕麦（Avena fatua）和狗尾草（Setaria viridis）的ACCase基

因第1781位由异亮氨酸突变为亮氨酸[17]。分子检测法能够快速实时检测田间抗性，但成本较高，更为重要的是对于非靶标突变的抗性种群不能有效检测。Kaundun等运用琼脂法，以存活率为指标，筛选出多花黑麦草（Lolium multiflorum）对唑啉草酯和炔草酯的抗性检测浓度分别为0.16、0.32 μmol/L，硬直黑麦草对甲基二磺隆碘盐（iodo-mesosulfuron）的抗性检测浓度为0.05 μmol/L，表明琼脂法检测结果与整株测定法的检测结果具有较高的相关性，检测周期为 10 d[10]。Kaundun等还将此方法应用在野燕麦、大穗看麦娘、狗尾草和奇异虉草（Phalaris paradoxa）对唑啉草酯的抗性检测[11]。[JP2]本研究在上述琼脂法的基础上进行改进，通过每天观测新根率变化来判断植株是否存活，结果显示，精唑禾草灵检测浓度为0.40 μmol/L，高效氟吡甲禾灵检测浓度为 0.20 μmol/L，[JP]炔草酯检测浓度为0.40 μmol/L。通过观测地上部分判断存活率需要7～10 d，通过观测生长新根的情况判断存活率只需要4 d，显著缩短了检测时间。琼脂法可以在施用除草剂之前对田间的菵草幼苗取样，进行抗性检测。例如在冬季或春季田间菵草1～3叶期时，用含有相应浓度除草剂的琼脂培养基进行检测，4 d后就能得到结果，及时指导农民科学选药，对有效治理菵草具有现实意义。此方法同样可以用于目前抗药性发展较快的日本看麦娘、看麦娘等其他杂草抗药性的检测及监测。

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