摘要 研究产几丁质酶枯草芽孢杆菌对立枯丝核菌的拮抗作用，采用对峙培养法、显微观察法和盆栽试验法考察产几丁质酶枯草芽孢杆菌对立枯丝核菌的拮抗作用，利用液体深层发酵法发酵枯草芽孢杆菌，用发酵液对立枯丝核菌进行拮抗试验，结果表明：枯草芽孢杆菌深层发酵产物可抑制立枯丝核菌菌丝的生长及菌核萌发，其中发酵液对菌丝生长抑制率高达88.1%，菌核萌发抑制率为77%，盆栽试验用发酵液原液施用防病效果可达70.0%。
关键词 几丁质酶；立枯丝核菌；棉花立枯病；抑制作用
中图分类号 Q939.9 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）22-0107-02
棉花立枯病是棉花苗期的主要病害之一，其病原菌为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）[1]。立枯丝核菌是一种严重危害农作物的土传病原菌，可引起稻麦棉和多种蔬菜瓜果等的病害，一般用化学农药防治。但化学农药对环境的污染问题至今很难有效地解决[2]。生物防治既能达到防治植物病害的作用，又几乎不存在环境污染的问题，是当前大力提倡和发展的防治方法[3]。除卵菌外所有真菌细胞壁中均含有几丁质。几丁质酶可以水解真菌细胞壁的几丁质从而抑制真菌生长[4]，在防治植物病虫害等方面具有非常重要的作用和意义[5]。
该研究利用产几丁质酶的枯草芽孢杆菌，验证根据发酵液分离提纯的几丁质酶对立枯丝核菌的菌丝生长及菌核萌发的抑制作用，通过盆栽试验，验证此菌株的发酵液防治由立枯丝核菌引起的棉花立枯病的效果，现将试验结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 试验材料
枯草芽孢杆菌：实验室保藏的产几丁质酶活性的菌株。棉花立枯丝核菌：由河北省农林科学院植物保护研究所鹿秀云老师提供。几丁质培养基：0.5% K2HPO4，0.5% KH2PO4，0.1% FeSO4·7H2O，0.1% ZnSO4·7H2O，500 mL 1%胶体几丁质，500 mL蒸馏水，15 g琼脂，pH值7.2。枯草芽孢杆菌试管斜面培养基：牛肉膏 3%，蛋白胨5%，氯化钠5%，pH值自然。枯草芽孢杆菌250 mL克氏瓶培养基：牛肉膏 3%，蛋白胨5%，氯化钠5%，pH值自然。250 mL克氏瓶培养基装量：70 mL。栽培盆：采用直径25 cm、高30 cm的花盆，取田间细肥土，灭菌，每盆装土10 kg。栽培槽的规格为长×宽=100 cm×30 cm。
1.2 试验方法
1.2.1 立枯丝核菌拮抗试验。应用对峙培养测定法和双周微菌核测定枯草芽孢杆菌对引起棉花立枯病的立枯丝核菌菌丝生长及菌核萌发和生长的影响
平板对峙试验采用PDA培养基[6]。平板中央转接直径为5 mm的立枯丝核菌菌丝块，在平板边缘对称的接上4枯草芽孢杆菌，30 ℃同步培养3 d，观察抑菌带。抑菌带宽度超过10 mm的作为拮抗菌株。
1.2.2 枯草芽孢杆菌液体深层发酵试验。具体操作步骤如下：
（1）菌种的制作。取4 ℃保藏的菌种，转接到试管斜面上，30～35 ℃恒温培养箱培养36～48 h，培养好的试管斜面再转接一次试管斜面，30～35 ℃恒温培养箱培养36～48 h，第2次培养好的试管斜面转接到克氏瓶斜面上，30～35 ℃恒温培养箱培养48～72 h。
（2）发酵工艺及条件控制。采用50 L不锈钢发酵系统进行发酵。发酵培养基：玉米粉0.5%，豆粉0.75%，蛋白胨0.56%，葡萄糖0.75%，硫酸锰0.16%，尿素0.23%，磷酸二氢钾0.45%，碳酸钙0.15%，酵母粉0.3%，磷酸氢二钠0.015%，消前pH值7.6±0.1，消后pH值6.4±0.1，泡敌20 mL，发酵罐装液量70%，灭菌温度121 ℃，时间30 min。使用2个克氏瓶种子，用500 mL无菌水清洗至接种瓶，发酵液温度降至40 ℃时接种。发酵条件控制见表1。
1.2.3 几丁质酶的分离纯化。发酵液经4 ℃、6 000 r/min离心20 min除菌体，得上清液。该上清液在4 ℃下经70%饱和度的硫酸铵盐析沉淀，沉淀物经蒸馏水透析，透析后上几丁质亲和层析柱，分别用pH值4.0的乙酸缓冲液和pH值7.4的磷酸缓冲液洗涤2次，再用pH值10.0的NaOH-甘氨酸缓冲液洗脱。洗脱液浓缩后上用pH值7.4的磷酸缓冲液平衡过的SephadexG-100层析柱，用同样的缓冲体系洗脱。合并相邻具有酶活的部分，浓缩后加至预先用pH值7.4的磷酸缓冲液平衡过的Sephacryl S-200层析柱，用同样的缓冲体系洗脱，得到酶液。
1.2.4 几丁质酶活力测定。采用DNS（3，5-二硝基水杨酸）测定还原糖的方法测定几丁质酶活性。取10 mL 30 ℃发酵液在4 ℃下5 000 r/min离心10 min后取上清，取4支1.5 mL离心管，分别加入上清液0.6 mL，其中1支作为对照直接放入100 ℃水浴灭活10 min，取出后加入0.7 mL质量分数为1%的胶态几丁质（pH值6.0）再放入45 ℃水浴；另外3支作为重复分别加入0.7 mL质量分数为1%的胶态几丁质（pH值6.0）后45 ℃水浴灭活60 min，然后放入100 ℃水浴10 min，分别取上清1 mL（空白对照为蒸馏水），加入已装有1.5 mL DNS的25 mL试管中，再加入蒸馏水1 mL后，100 ℃水浴6 min，取出后流水冷却，补充蒸馏水至4 mL，震荡后放置20 min测量OD540。酶活力单位（U）定义：在pH值6.0、40 ℃条件下，1 min水解胶体几丁质产生相当于1 μg N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量。
采用方差分析和SPSS19数据处理系统进行试验数据的统计分析。
2 结果与分析
2.1 几丁质酶对立枯丝核菌菌丝生长的影响
将酶液配制成20 U/mL，然后用无菌水进行稀释，稀释倍数分别为5、10、20倍。在PDA平板上滴加2 mL不同酶活的几丁质酶提取液，在平板上涂布均匀，在平板中央移入一块直径5 mm、培养3 d、生长良好的立枯丝核菌，结果见表2。可以看出，枯草芽孢杆菌对立枯丝核菌有拮抗作用，能够破坏菌丝生长。
2.2 几丁质酶对立枯丝核菌菌核萌发的影响
在PDA平板上滴加2 mL不同酶活的几丁质酶提取液，在平板上涂布均匀，每个平板放10个人工培养好的立枯丝核菌菌核[7]，结果见表2。可以看出，枯草芽孢杆菌对立枯丝核菌有拮抗作用，能够抑制菌核萌发。
2.3 棉花盆栽试验
棉花种子保湿培养，露白后播种，待棉花长出第2～3片真叶后开始接种。将PDA中培养1周的立枯丝核菌接种于根围土壤中，病原菌接种前用剪刀破坏根系。发酵液处理均做伤根处理，对照不接发酵液，加无菌水，伤根处理，3次重复，结果见表3。可以看出，枯草芽孢杆菌菌株发酵液在棉花苗期施用可以有效防治由立枯丝核菌引起的棉花立枯病。
3 结论
产几丁质酶的枯草芽孢杆菌对引起棉花立枯病的立枯丝核菌具有拮抗作用，能够破坏菌丝生长，抑制菌核萌发，其代谢产物几丁质酶具有同样的效果[8]。采用此株枯草芽孢杆菌发酵液在棉花苗期施用可以有效防治由立枯丝核菌引起的棉花立枯病。提取的几丁质酶对菌丝生长抑制率为88.1%，菌核萌发抑制率为77%，发酵原液对立枯丝核菌引起的棉花立枯病防效高达70.0%。
4 参考文献
[1] 贾辉，吕和平，沈慧敏，等.不同杀菌剂对立枯丝核菌的室内毒力测定[J].甘肃农业大学学报，2007（6）：99-101.
[2] 何迎春，高必达.立枯丝核菌的生物防治[J].中国生物防治，2000，16（1）：31-34.
[3] 张楷正.立枯丝核菌拮抗菌的分离鉴定及其生理特性研究[J].北方园艺，2010（21）：39-41.
[4] 赵秋敏，陈月华，蔡峻，等.一株产几丁质酶、抑真菌的侧孢芽孢杆菌[J].中国生物防治，2006，22（S1）：42-46，
[5] 方中达.植病研究方法[M].3版.北京：中国农业出版社，1998：46-50.
[6] 李丽，杨雪松，刘红全.微生物几丁质酶的特性及其应用的研究进展[J].广西民族大学学报：自然科学版，2011，17（1）：92-96.
[7] 咸洪泉，李雅华.木霉菌株Td31代谢产物对立枯丝核菌的拮抗作用[J].沈阳农业大学学报，2009，40（5）：566-570.
[8] 郑梅霞，陈峥，刘波，等.解几丁质类芽胞杆菌几丁质酶活性及其次生代谢物的测定[J].福建农业学报，2014，29（5）：492-497.