尖吻鲈仔鱼骨骼发育观察

材料依据。[本研究切入点]目前，有关尖吻鲈的研究主要集中在养殖技术（Nankervis and Southgate，2006；张俊等，2012；Ribeiro et a1.，2015）、生理生化（陆鑫等，2009；林黑着等，2010；袁丰华等，2009，2010）、形态特征（张成锋等，2008）、营养成分分析（闵宽洪等，2008；许郑超，2016）、渔业资源（韩杨等，2014）、病害诊断与防治（文琳等，2015）及其分子生物学（司李真等，2017）等方面，而针对尖吻鲈骨骼系统早期发育与畸形鉴定方面的研究仍是空白。[拟解决的关键问题]采用软骨一硬骨双染染色技术，连续观测0-23日龄尖吻鲈仔鱼发育过程中脊柱及附肢骨骼中的胸鳍、背鳍、腹鳍、尾鳍、臀鳍形成及生长发育特征，揭示尖吻鲈仔鱼期的骨骼生长发育规律，为开展尖吻鲈骨骼发育相关基因研究及鱼类化石探究提供基础资料。

1材料与方法

1.1尖吻鲈仔鱼样本准备

尖吻鲈仔鱼早期发育的各阶段样本由中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心通过人工培育养殖获得。尖吻鲈受精卵购自海南省陵水县，受精卵放入27-28℃水中预温20 min后，缓慢倒入500 L的孵化器中集中孵化，待受精卵破膜后从孵化器中移出，放人800 L的育苗桶中进行下一步的培育工作。在育苗阶段保持各育苗桶的鱼苗数约20尾/L，光照强度300-3000 lX，水温29-30℃，盐度31%0-33%0，pH 7.7-8.1，溶解氧保持在7.5±0.7 mg/L，同时以气石充气增氧，调整好所需气量降低气泡破裂对鱼苗的伤害。育苗桶中部安装排水管，采取溢流方式排换水，排水口包被80目筛网防止鱼苗逃逸。育苗过程中要及时吸污清底，防止饵料过剩，保持水体清洁。在尖吻鲈鱼苗生长发育阶段，随着鱼苗个体的生长所投喂饵料粒径逐渐增大，投喂饵料依次为轮虫、卤虫无节幼体、桡足类等适口的浮游动物。孵化后第3 d（尖吻鲈开口阶段）投喂轮虫，投喂密度控制在15000个/L；9日龄起开始投喂卤虫无节幼体，投喂密度控制在5000个/L；11日龄以后开始投喂桡足类；20日龄开始进行人工饵料驯化，每日投喂4次，且在第2次投喂后补充桡足类，以保证尖吻鲈正常生长的营养需求。根据鱼苗进食量，实时调整投喂量。

1.2样品处理及方法

试验样品为孵化后0-23日龄的尖吻鲈鱼苗，每天于投喂饵料前随机挑取5-10尾鱼苗，通过解剖镜目镜中的测微尺（mm）进行生物学指标测量（邓平平等，2017），测量后的样本用福尔马林浸泡避光保存。尖吻鲈骨骼发育样品采用软骨一硬骨双染染色技术进行染色（张宗锋等，2015），其操作步骤分为前期处理、软骨染色和硬骨染色3个阶段。其中，前期处理包括样品的固定（10%中性甲醛溶液）、脱水（70%-90%的梯度酒精）及透明（2%KOH溶液）；软骨染色选用阿尔新蓝染液（Alcian blue 8GX，Aladdin Zn-dustrial Corporation），加蒸馏水脱浮色，再用3%H202脱色，预透明处理后用甘油进行梯度漂洗；硬骨染色选用茜素红（Alizarin red monohvdrate，天津市大茂化学试剂厂出品），着色后重复上述的脱浮色、脱色、甘油梯度透明等步骤，最后将处理好的仔鱼样品置于干净的玻璃瓶中并注入新的纯甘油密封保存。

1.3显微镜观察分析

染色处理好的仔鱼样品在Olympus SZ40型生物显微镜下进行观察，详细记录仔鱼各发育时期的骨骼形态特征变化，同时应用数码相机显微摄影采集图像信息，对尖吻鲈脊椎、脊柱骨骼及背鳍、胸鳍等附肢骨骼发育的主要形态特征进行连续观察，并以Auto CAD 2014测量脊椎、脊柱长度和拍照，最后采用Photoshop对拍摄图片进行编辑和处理。

2结果与分析

2.1尖吻鲈仔鱼脊柱及附肢骨的发育特征

完成基础发育后，尖吻鲈脊椎骨24枚，肋骨12对，有背肋。早期的尖吻鲈仔鱼脊索呈管状，1日龄（图1-A）的尖吻鲈全长1.70±0.10 mm，其身体细长笔直，骨骼尚未开始骨化，附肢骨骼未出现，卵黄明显收缩。3日龄（图1-B）鱼苗全长1.87±0.05 mm，随着尖吻鲈鱼苗生长，脊索发生自然弯曲，头部与躯干部呈139°-149°弯曲，脊索周围开始出现明显的突起，随后胸鳍、尾鳍开始发育，尾鳍原基出现。5日龄（图1-C）仔鱼全长2.03±0.05 mm，脊索末梢形成并开始向上弯曲，随之出现背鳍原基，并开始出现胸鳍支鳍骨原基，尾鳍快速发育。鱼苗尾鳍发育速度明显加快，说明此阶段获得更快的游泳能力是首选发育方向，游泳能力的提升能大幅度提高获取饵料和躲避天敌的能力，进而提高生存概率。

9日龄（图1-D）仔鱼全长2.73±0.05mm，其脊索出现弯曲，髓弓、脉弓开始出现于表面，脊柱开始发育，软骨質背鳍支鳍骨也开始出现；尾杆骨形成并呈明显上翘趋势，随之尾鳍初步形成；背鳍发育进入快速阶段，胸鳍原基、背鳍鳍皱开始出现，泄殖孔后出现鳍皱，臀鳍开始发育。13日龄（图1-E）仔鱼全长3.48±0.05mm，胸鳍鳍条出现且在该日龄基本成形，背鳍则先后长出软骨质鳍条，尾鳍鳍条也在该阶段逐渐增多，尾鳍骨骼发育基本完成；脊索上开始出现髓棘和脉棘。脊柱发育明显提升了鱼体的支撑和运动能力。

15日龄（图1-F）仔鱼全长4.30±0.05mm，其背鳍生长速度加快，胸鳍鳍条数增多，腹鳍原基出现并开始发育，背肋和腹肋以软骨的形式生长，尾杆骨开始缩短，脊索末端持续上翘，尾鳍鳍条生长迅速；腹鳍鳍条开始生长，背肋和腹肋生长迅速，背鳍和胸鳍发育接近完全，其鳍条发育完整、清晰可见。19日龄（图1-G）仔鱼全长9.84±0.05mm，其腹鳍和臀鳍发育接近完全，鳍条清晰，胸鳍出现鳍棘，脊柱两端出现明显的分节和硬骨环，开始出现骨化现象，脊柱从两端向中间开始骨化，尾鳍逐渐骨化，各附肢鳍条发育接近完整。背鳍、胸鳍、腹鳍和臀鳍发育接近完整，说明鱼苗对平衡和方向控制能力的提升有利于提高其生存能力。

21日龄（图1-H）仔鱼全长10.96±0.05mm，其背肋和腹肋从脊柱基部向两端的方向开始骨化，尾鳍骨化基本完成，髓弓、脉弓、髓棘和脉棘也开始骨化。23日龄（图1-I）仔鱼全长11.20±0.05mm，其胸鳍发育完全，鳍棘还在逐渐骨化，鳍条开始骨化并出现分节，胸鳍骨化程度存在差异，各附肢骨骼骨化接近完全，仔鱼的骨骼发育基本完全，脊椎骨化接近完全，仔鱼变态完成。骨骼发育的完成标志着鱼体形态已固定，至此以后鱼苗的外形不会发生明显变化，只有体色和大小的变化。

2.2尖吻鲈仔鱼骨骼发育畸形现象

尖吻鲈仔鱼脊柱骨骼畸形中最普遍的是椎体轻微畸形，表现为椎体侧脊轻微变形。这种畸形仅发生于第16～24枚脊椎骨之间，每尾仔鱼最多发生1～4枚的脊椎骨变形。脊柱畸形首次出现在10日龄（图2-A）的尖吻鲈仔鱼中，至22日龄时畸形率占样本采集总量的8%，其中前期畸形的仔鱼在14～15日龄时基本被淘汰。在20～22日龄的仔鱼样本中发现两尾较严重的脊椎畸形个体，其脊椎骨、棘弓多处扭曲变形（图2-B）或缺失（图2-C）。高畸形率出现阶段的确定，可为有针对性地降低畸形率提供准确的时间节点。

3讨论

至今，已有较多针对仔鱼骨骼发育的相关研究报道。佟雪红（2010）对大菱鲆（Scophthalmus maxi-mus）早期发育过程中骨骼畸形的发生进行深入分析，陈渊戈等（2011）描述了刀鱭（Coilia nasus）仔鱼早期脊柱和附肢骨骼发育的时序及特征；田文斐（2012）研究了鳜鱼（Siniperca chuatsi）骨骼构成与其摄食习性的关系。本研究结果表明，尖吻鲈仔鱼的胸鳍在3日龄开始发育，背鳍在5日龄开始发育，腹鳍在15日龄开始发育，20日龄尾鳍发育完全。尖吻鲈仔鱼骨骼的发育时序与前人的相关研究（Kohno eta1.，1996）相同，但发育的时间节点略有差异，其中，胸鳍和背鳍的发育时间较Kohno等（1996）报道的时间早，而腹鳍和尾鳍的发育时间较Kohno等（1996）报道的时间晚。究其原因可能与投喂饵料、自身的消化能力及生长环境的不同有关，也可能是地理隔离种群差异所造成（郑珂等，2016）。

不同种类的鱼脊椎骨骼结构也有所不同，尖吻鲈的脊椎骨24枚、肋骨12对，而青石斑鱼的脊柱由24枚脊椎骨构成（王秋荣等，2012）、隆肛蛙（Ranaquadrana）蝌蚪具9块脊椎骨（李翠萍，2013）。同科不同属的鱼脊椎骨骼也可能存在明显差异，李仲辉和杨太有（2001）对大口黑鲈和尖吻鲈的骨骼系统进行对比分析，结果发现大口黑鲈的脊椎骨有32枚，肋骨14～15对，与尖吻鲈的肋骨（12对）存在明显差异，但二者的尾骨发育十分接近，均由5片尾下骨、1片尾上骨和1片尾杆骨构成。李仲辉等（2012）研究还发现长尾大眼鲷（属鲈形目）的脊椎骨20枚、肋骨7对，尾骨由5片尾下骨、1片尾上骨和1片尾杆骨构成，与尖吻鲈的尾骨构成相似，但脊椎骨和肋骨的数目存在明显差异。不同的脊柱和附肢骨发育时序及脊椎骨数目，导致其体型、体长、体高等系列生物学特征存在着明显区别，说明鱼类早期的骨骼发育时序特征与骨骼结构和数目密切相关。因此，通过鱼类的骨骼发育和生长状况掌握鱼体的生理特征变化，可为鱼类基因表达及性状研究提供理论依据。

在尖吻鲈仔鱼早期发育过程中，各鳍支鳍软骨、脊柱、脊髓骨、背肋、腹肋等均会经历一个骨化过程。尖吻鲈附肢鳍骨的发育时序与其他鱼类的差异不明显，均表現为腹鳍发育略慢。由于尖吻鲈仔鱼的髓弓和脉弓发育顺序不同，对脊柱骨化也有明显影响，髓弓从颈部向尾部发展，脉弓则是从体中部向两边的方向发展，脊柱是由两端到中间的方向发生骨化，与日本鲲（Engraulis，aponicus）（Balart，1995）、绯小鲷（Pagellus erythrinus）（Sfakianakis et a1.，2004）等鱼类的骨骼骨化顺序一致，说明大部分鱼类早期骨骼的骨化在生物发育和生物遗传进化上基本一致，不同种鱼类在骨骼骨化发育发展上的进程也基本一致。

本研究发现尖吻鲈仔鱼在发育过程中，尤其是骨化过程中偶见畸形发生，早期的畸形个体在竞争中会很快被淘汰，只有极少数能够存活下来。早期尖吻鲈畸形发生会导致鱼苗死亡，育苗存活率降低；而后期发生畸形会使鱼苗生长缓慢，饵料系数低，鱼体比例不协调，游泳速度变慢等，导致养殖成本增加。Fraser和de Nys（2005）研究表明，孵化后24～26日龄是尖吻鲈骨骼畸形突发率较高的时段；而本研究发现尖吻鲈仔鱼脊柱骨骼畸形多发生在孵化后20-22日龄，其原因可能是：①与投喂的饵料种类、数量和质量有关，②与育苗地区不同的温度、饵料等生存环境有关；③与地理位置不同有关，即地域差异导致种内差异。因此，准确掌握不同鱼类的骨骼发育规律有助于识别、分析畸形发生的时间及原因，有效防止畸形发生。

4结论

尖吻鲈仔鱼脊柱及附肢骨的发育顺序与其他鱼类基本一致，但发育时间节点有所不同。尖吻鲈仔鱼的骨骼发育畸形首次出现在10日龄左右，但主要集中在20-22日龄。

（责任编辑 兰宗宝）

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